本发明专利技术涉及一种新型的甘露聚糖酶，其氨基酸序列为SEQ?ID?NO:?1。并将该酶分别转化入里氏木霉和毕赤酵母中，构建重组表达工程菌株。本发明专利技术提供了一个新型甘露聚糖酶基因，并分别构建了重组表达该基因的毕赤酵母工程菌和里氏木霉工程菌。所述毕赤酵母工程菌和里氏木霉工程菌所产甘露聚糖酶的最适作用pH为4.5，最适作用温度为60℃。本发明专利技术的甘露聚糖酶耐酸，耐高温，可广泛用作饲料添加剂，能有效提高饲料的利用率，从而减少养殖中饲料的使用量，节约粮食资源和养殖成本，增加生产效益。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于微生物工程生物
，具体涉及一种新型的甘露聚糖酶，及用于表达该酶的重组表达工程菌。
技术介绍
甘露聚糖酶包括外切酶、内切酶和甘露糖苷酶，三种酶的协同作用才能将甘露聚糖彻底降解。其中，β-l，4-D-甘露聚糖酶(EC 3. 2.1. 78)又称为甘露聚糖酶，属于内切酶；它能水解含有β_1，4-D-甘露糖苷键，生成甘露寡糖或甘露多糖，属于半纤维素酶类。甘露聚糖是以β-l，4-D-吡喃甘露糖苷键连接的线状多糖，如果主链某些残基被葡萄糖取代，或半乳糖通过α-1，6-糖苷键与甘露糖残基相连形成分支，则称为异甘露聚糖，主要有半乳糖甘露聚糖、葡萄甘露聚糖、半乳葡萄甘露聚糖(齐军茹等，2002，中国食品添加剂；许牡丹等，2006，动物医学进展)。 甘露聚糖酶在饲料、食品、造纸、石油开采及生物研究技术等多方面具有广泛的应用前景；因此，甘露聚糖酶的研究和开发越来越多。甘露聚糖是仅次于木聚糖的第二大的半纤维素成分。饲料的主要原料如豆柏、小麦和麸皮等的细胞壁主要成分是甘露聚糖；一方面它是非淀粉多糖的抗营养因子；另一方面，低聚甘露糖具有的保健功能(陈小兵等，2005，生物工程杂志；Chesson A, etc. , 1987, In Recentt Advance in Animal Nutrition)。因此，甘露聚糖酶业已是饲料酶制剂使用量最大的单酶之一。产甘露聚糖酶的微生物很多，包括芽孢杆菌和丝状真菌等。而工业化生产甘露聚糖酶的菌株主要来自诱变选育的高产菌株或高效表达的基因工程菌，如通过诱变选育芽抱杆菌AM-001的甘露聚糖酶的酶活力由36 U/ml提高到了 430U/ml耐。美国ChamGen公司选育的迟缓芽孢杆菌产甘露聚糖酶活力达到了 400U/ml。但是，随着分子生物学技术的发展，利用工程菌异源高效表达生产甘露聚糖酶是当前的主要手段。利用毕赤酵母表达生产来自Bacillus subtilis的甘露聚糖酶其酶活达到约40000U/ml ;同样,毕赤酵母表达生产来自曲霉的甘露聚糖酶其酶活达到约343U/ml (李松瑜等，2009，生物技术通讯)。目前已商业化的甘露聚糖酶主要来自芽孢杆菌、木霉和青霉。芽孢杆菌所产甘露聚糖酶属于中性甘露聚糖酶，最适pH为6. 5，不耐胃酸和胃蛋白酶。木霉和青霉所产甘露聚糖酶虽具有耐酸性特点，但是不耐受胃蛋白酶。而甘露聚糖酶在单胃动物体内的作用位点决定了饲料中使用的甘露聚糖酶必须是酸性的。因此，为了更好的提高单胃动物对含甘露聚糖饲料的利用率，就需要获得能够在低PH条件下具有高活性的甘露聚糖酶。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种新型甘露聚糖酶及其重组表达工程菌。本专利技术通过将来源于斜卧青霉(Penicillum decumbens)的甘露聚糖酶基因分别转化入里氏木霉和毕赤酵母中，构建重组表达工程菌株。本专利技术的甘露聚糖酶可广泛用作饲料添加剂，提高养殖动物的饲料利用率。本专利技术一个方面提供一种新型的甘露聚糖酶，其特征在于I)其氨基酸序列为SEQ ID NO:1的甘露聚糖酶；2)其氨基酸序列与SEQ ID NO:1同源性高于75%的甘露聚糖酶；3)在I)或2)中的氨基酸上发生取代、缺失或添加一个或数个氨基酸得到的，具有甘露聚糖酶活性的酶。本专利技术另一方面提供了编码上述甘露聚糖酶的基因，其一种核苷酸序列为SEQ ID NO: 2。本专利技术的甘露聚糖酶，去掉信号肽后的氨基酸序列为SEQ ID NO: 3。其核苷酸的序列为 SEQ ID NO: 4。本专利技术提供了一种表达载体，其包含上述编码基酸序列为SEQ ID NO: 3的甘露聚糖酶的核苷酸。本专利技术另一方面提供了一种表达宿主细胞，其携带有表达上述去掉信号肽的甘露聚糖酶基因的表达载体。上述表达宿主细胞为毕赤酵母(Pichia pastoris)。上述表达宿主细胞为里氏木霉(Trichoderma reesei)。本专利技术的甘露聚糖酶用于制备饲料添加剂。本专利技术提供了一个新型甘露聚糖酶基因，并分别构建了重组表达该基因的毕赤酵母工程菌和里氏木霉工程菌。所述毕赤酵母工程菌和里氏木霉工程菌所产甘露聚糖酶的最适作用PH为4. 5，最适作用温度为60°C。本专利技术的甘露聚糖酶耐酸，耐高温，可广泛用作饲料添加剂，能有效提高饲料的利用率，从而减少养殖中饲料的使用量，节约粮食资源和养殖成本，增加生产效益。 附图说明图1 :毕赤酵母工程菌发酵上清液SDS-PAGE电泳检测分析图，其中箭头所指处即为重组表达的甘露聚糖酶。图2 :里氏木霉工程菌发酵上清液SDS-PAGE电泳检测分析图，箭头所指处即为重组表达的甘露聚糖酶。图3:重组表达的甘露聚糖酶最适作用pH分析图。图4:重组表达的甘露聚糖酶最适作用温度分析图。具体实施方式以下实施例是为了更好地说明阐述本
技术实现思路
，本领域相关的技术人员可以借助实施例更好地理解和掌握本专利技术。但是，本专利技术的保护和权利要求范围不限于所提供的案例。实施例1斜卧青霉甘露聚糖酶基因的克隆1.1总DNA的提取将斜卧青霉(P. decumbens)过夜培养,取适量菌体置于离心管中，13000 rpm离心 5 min，弃上清；加入 400 μ I 抽提缓冲液(100 mM Tris-HCl, 100 mM EDTA, 250 mM NaCl,1%SDS);然后加IOOmg石英砂或玻璃珠，在珠打仪剧烈振荡2min左右；65°C水浴20min后，加入200 μ I IOM NH4AC,冰浴IOmin ;13000rpm离心lOmin，取上清;加入2倍体积的无水乙醇，-20°C放置30min ； 13000 rpm离心lOmin，弃上清；用70%乙醇洗涤2次；晾干，加入水溶解,于-20°C保存。1. 2总RNA的制备OMEGA公司的E. Z. N. A. Fungal RNA Kit制备斜卧青霉的mRNA，其制备过程参照试剂盒的操作手册。1. 3基因克隆以1.1中提取的基因组总DNA为模板，分别利用引物对(ATGTTGTACT CATCGGCG和TCAGATCGCAGCGACATG)进行 PCR 扩增。PCR 扩增条件为 95°C 4min ；94°C 40S ；58°C 35S,72°C1. 2min 25个循环；72°C 7min。利用凝胶回收试剂盒回收PCR扩增产物。 以1. 2中提取的基因组总RNA为模板，扩增其cDNA序列。采用TaKaRa公司的PrimeScript RT-PCR Kit 扩增 cDNA 基因序列。1. 4测序分析将1. 2中回收的扩增产物分别连接到pMD18 T-载体，相应的克隆载体分别命名为pMDT-Manl和pMDT_Man2 ;最后把阳性克隆送至北京华大基因研究中心进行测序分析。测序经比对发现DNA序列和cDNA序列间完全同源，这说明该基因序列没有内含子序列。该甘露聚糖酶的氨基酸序列为SEQ ID NO:1，其编码核苷酸序列为SEQ ID NO: 2。经NCBI 的 BLAST 比对分析显不，SEQ ID NO: 2 与 Neosartorya fischeri 菌的甘露聚糖酶基因(序列号XM_001262743.1)核苷酸序列同源性最高，同源性为73% ;而蛋白序列分析显示，该酶属于糖水解酶第2家族,SEQ ID NO本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种甘露聚糖酶，其特征在于：1）其氨基酸序列为SEQ?ID?NO:?1的甘露聚糖酶；2）其氨基酸序列与SEQ?ID?NO:?1同源性高于75%的甘露聚糖酶；3）在1）或2）中的氨基酸上发生取代、缺失或添加一个或数个氨基酸得到的，具有甘露聚糖酶活性的酶。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：黄亦钧，程斯达，康丽华，王华明，曲音波，刘国栋，陈梅，
申请(专利权)人：青岛蔚蓝生物集团有限公司，
类型：发明
国别省市：
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