一种半乳甘露聚糖抗原及其制备方法技术

本发明专利技术涉及一种半乳甘露聚糖抗原的制备方法，将富含半乳甘露聚糖的生物体经破碎、离心、醇沉、洗涤、干燥处理，分离得到半乳甘露聚糖粗提物；将制得的半乳甘露聚糖粗提物依次进行肼解、水解；向水解产物中加入酶进行酶解，并除去酶解产物中的酶及小分子物质；产物经离子交换柱、亲和层析柱及凝胶色谱纯化，得到半乳甘露聚糖抗原纯品；对得到的半乳甘露聚糖抗原纯品，进行鉴定。使用本发明专利技术制备方法得到的半乳甘露聚糖抗原纯度高，消除了半乳甘露聚糖粗提物中可能含有的半乳糖胺、蛋白、杂糖等的干扰，可用于烟曲霉菌抗体的制备。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及抗原制备领域，特别涉及。
技术介绍
半乳甘露聚糖（Galactomannan，简称GM)存在于真菌（如曲霉菌属、青霉菌属等） 及胚乳豆类植物（如萌芦巴、瓜儿豆、角豆等）细胞壁中，广泛应用于食品和医学、临床领 域。 目前，由于抗生素和免疫制剂的大量使用，真菌感染呈逐年上升趋势，其中，曲霉 特别是烟曲霉已经逐渐成为临床上一种重要的致病真菌。半乳甘露聚糖作为曲霉菌细胞壁 的骨架，同时也是曲霉分泌性抗原，半乳甘露聚糖抗原被认为是侵袭性曲霉病早期诊断的 靶标。因此，获得特异性的抗半乳甘露聚糖的抗体，对于曲霉病的诊断具有重要的意义，然 而，采用重组半乳甘露聚糖抗原制备得到的抗体，仅部分能与烟曲霉菌丝体中的半乳甘露 聚糖抗原位点特异结合，采用天然半乳甘露聚糖抗原可能解决该问题，然而，目前天然半乳 甘露聚糖抗原提纯存在一定困难。 现有技术中，天然半乳甘露聚糖抗原主要从烟曲霉菌培养液中分离，提取的半乳 甘露聚糖抗原主要为粗提物，使用乙醇沉淀培养液上清液，再用乙醇清洗醇沉后的组分，得 到抗原粗提物。然而，当半乳甘露聚糖作为用于制备抗体的抗原使用时，由于粗提物中含有 糖胺、蛋白等杂质，无法满足抗体制备的要求，现有技术中也有对粗提物进行进一步纯化的 研宄，例如申请号为CN201110289099. 8的中国专利技术专利申请公开了将半乳甘露聚糖粗提 物进行超滤处理，将小于一定分子量的蛋白质、杂糖和糖蛋白滤除，从而得到纯度90%以上 的半乳甘露聚糖抗原。然而，使用该方法对半乳甘露聚糖进行纯化，仅能除去分子量明显小 于半乳甘露聚糖分子量的杂质，当杂糖或蛋白质的含量与半乳甘露聚糖分子相近或大于半 乳甘露聚糖分子时，则无法滤除。此外，现有技术中也有通采用肼解、水解或层析的方式对 粗提物进行提纯，然而，该纯化主要用于半乳甘露聚糖结构的表征，无法保证半乳甘露聚糖 的纯度及合适的分子量分布，不利于产业批量生产。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种纯度更高且适于批量生产的半乳甘露聚糖抗原及其制 备方法。 为了实现本专利技术的目的，本专利技术采用如下技术方案： -种半乳甘露聚糖抗原的制备方法，包括如下步骤： (a)富含半乳甘露聚糖的生物体经破碎、离心、醇沉、洗涤、干燥处理，分离得到半 乳甘露聚糖粗提物； (b)将步骤（a)制得的半乳甘露聚糖粗提物依次进行肼解、水解； (C)将步骤（b)中的水解产物中加入酶进行酶解，并除去酶解产物中的酶及小分 子物质； (d)将步骤（c)得到的产物经离子交换柱、亲和层析柱及凝胶色谱纯化，得到半乳 甘露聚糖抗原纯品。对得到的半乳甘露聚糖抗原纯品，进行鉴定。 优选的，所述生物体包括生物种群、个体或者离体组织，具体的包括真菌或胚乳豆 类植物；所述真菌包括曲霉菌、毛霉菌、青霉菌、珠菌、念珠菌等，所述胚乳豆类植物包括萌 芦巴、瓜儿豆、角豆、刺槐豆、关华豆、皂荚、海红豆、银合欢等。本领域技术人员知晓，所述生 物体只要富含半乳甘露聚糖即可，并不限于上述具体生物。 在一个具体的实施方式中，优选的，所述步骤（a)具体包括：将富含半乳甘露聚糖 的生物体培养到半乳甘露聚糖含量最高时，灭活处理；过滤，将灭活后的生物体与培养液和 /或组织液分离，生物体进行细胞破碎、离心，将细胞质和细胞壁分离，得到有效组分；所述 有效组分经过醇沉，洗涤，干燥等工艺处理，得到半乳甘露聚糖粗提物。其中，所述有效组分 是指富含半乳甘露聚糖的组分，如曲霉菌的发酵液、细胞质和细胞壁成分，富含半乳甘露聚 糖的植物胶（如萌芦巴胶、塔拉胶、刺槐豆胶、角豆胶、瓜儿豆胶、关华豆胶等）。 优选的，所述生物体培养过程中使的培养基选自PDA培养基、沙氏培养基、察氏培 养基、麦芽汁培养基等培养基中的一种或多种。培养方法包括使用固体培养基的平板培养 和斜面培养，使用液体培养基的摇瓶振荡培养和发酵罐培养等，温度20-40°C，时间3-15 天。 优选的，所述灭活方法包括化学试剂、射线、高温、高渗透压等。 优选的，所述细胞破碎使用机械破碎法、溶胀法、酶解法等方法中的一种或多种。 优选的，醇沉使用甲醇或者乙醇，醇沉的体积为有效组分溶液体积的2-6倍，醇沉 时间为1-48小时。更优选的，醇沉体积为4倍有效组分溶液体积，醇沉时间为6-24小时。 优选的，洗涤使用甲醇或者乙醇；干燥方法为烘干、冻干、减压干燥中的一种或多 种。 在一个具体的实施方式中，优选的，所述步骤（a)还包括活性炭脱色。 具体的，将有效组分溶于水中，加入活性炭粉末，室温脱色6-24小时，待溶液棕黄 色褪去，漏斗过滤，滤液经0. 22 μ m滤膜过滤，即得到去除色素的半乳甘露聚糖提取物。优 选的，每毫升溶液中加入〇. 02-0. 05g活性炭。 在一个具体的实施方式中，优选的，所述步骤（b)中肼解时：每毫克半乳甘露聚糖 粗提物中加10-100 μ 1的无水肼，肼解温度为100-150°C，肼解时间为2-12小时。更优选 的，所述肼解温度为110_130°C肼解时间为3-8小时。 优选的，所述步骤（b)中肼解具体包括：向每毫克半乳甘露聚糖粗提物中加 10-100 μ 1入无水肼，混匀，密封，在100-150°C下保温2-12小时；将所得的肼解产物加入乙 醇进行离心、洗涤和冷冻干燥，得到肼解后的干粉。 在一个具体的实施方式中，优选的，所述步骤（b)中水解采用亚硝酸水解，亚硝酸 水解时亚硝酸浓度为I. 5-5. 0m〇l/L，水解温度为30°C，水解时间为2-12小时，水解结束后 通入空气。更优选的，所述亚硝酸浓度为I. 6-2. 4mol/L，水解时间为3-8小时。 优选的，所述步骤（b)中水解具体包括：将肼解后的干粉加入浓度为I. 5-5. Omol/ L，水解温度为30°C，水解时间为2-12小时，水解结束后通入空气；水解液经水透析过夜，透 析液中加入乙醇进行离心、洗涤和冷冻干燥，得到水解后的干粉。 经肼解和水解后，有效除去半乳甘露聚糖中的蛋白和氨基；并通过对肼解、水解条 件的优化，使肼解和水解过程中半乳甘露聚糖的损失量较小，且蛋白残余量不足4%。 在一个具体的实施方式中，优选的，步骤（C)中，所述酶选自葡聚糖酶、纤维素酶、 果胶酶、几丁质酶中的一种或多种，酶解缓冲液为0.0 lM PBS，pH为7. 4,温度为20-60°C，酶 解时间为6-48小时。更优选的，所述酶解温度为30-45°C，酶解时间为12-24小时。 优选的，所述步骤（c)中酶解具体包括：将水解后的干粉制备成溶液，加入浓度 为2-5%的葡聚糖酶、纤维素酶、果胶酶、几丁质酶等中的一种或者种，酶解缓冲液为0.0 lM PBS，pH为7. 4,在20-60°C下酶解6-48小时；采用sevage法（加入正丁醇和氯仿溶液，振 荡，离心）除去酶，采用透析、超滤或Sephadex G分子筛等方法除去小分子物质。 通过酶解除去产物中混杂的葡聚糖、几丁质、纤维素、果胶等多糖杂质，进一步提 高了半乳甘露聚糖的纯度。 在一个具体的实施方式中，优选的，步骤（d)中，离子交换柱为阴离子交换柱。 优选的，阴离子交换柱为Mono Q阴离子交换柱，缓冲液和溶剂均为TriS-HCl缓冲 液、PH为7~8.5、温度4°C。 由于半乳甘露聚糖纯品不带电荷，带负电荷的蛋本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种半乳甘露聚糖抗原的制备方法，包括如下步骤：(a)富含半乳甘露聚糖的生物体经破碎、离心、醇沉、洗涤、干燥处理，分离得到半乳甘露聚糖粗提物；(b)将步骤(a)制得的半乳甘露聚糖粗提物依次进行肼解、水解；(c)将步骤(b)中的水解产物中加入酶进行酶解，并除去酶解产物中的酶及小分子物质；(d)将步骤(c)得到的产物经离子交换柱、亲和层析柱及凝胶色谱纯化，得到半乳甘露聚糖抗原纯品。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：周泽奇，刘春龙，翟栓柱，张舟，李宁，粟艳，
申请(专利权)人：丹娜天津生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：天津;12