一种龙胆酸性均一多糖及其提纯方法和应用技术

本发明专利技术公开了一种龙胆酸性均一多糖及其提纯方法和应用，属于龙胆酸性均一多糖提纯领域。所述龙胆酸性均一多糖，包括如下组分的单糖及其摩尔百分含量：1-1.5％岩藻糖、11-12％鼠李糖、22-23％阿拉伯糖、17-18％半乳糖、3-3.5％葡萄糖、3-3.5％木糖、0.5-1％甘露糖、39-40％半乳糖醛酸。本发明专利技术实现了对龙胆多糖的进一步分离纯化，获得了重均分子量为5.8×104Da的龙胆酸性均一多糖，其抗凝血活性高，制备方法简单，避免了残留的化学试剂存在的安全隐患，具有良好的开发应用前景。

【技术实现步骤摘要】
一种龙胆酸性均一多糖及其提纯方法和应用
本专利技术属于龙胆多糖提纯
，具体涉及一种龙胆酸性均一多糖及其提纯方法和应用。
技术介绍
随着人们生活水平的提高及饮食结构的改变，心脑血管疾病已成为继癌症死亡后的主要原因。大多数血栓患者在手术期间需要抗凝血治疗。而肝素是最常见的用于临床治疗的抗凝血药物，在上述疾病治疗中发挥着十分重要的作用。然而，肝素的生产大多来源于动物脏器，有携带致病微生物以及动物致敏原、致热原的隐患，可能对人体健康造成危害。此外，肝素的使用常常伴随着一些副作用如：易引起出血、高血钾症、肝素诱导性血小板减少症等。因此，从天然产物中寻找抗凝血活性成分，或将其主结构作为先导化合物进而研发新药，或开发功能性食品，具有毒性小、研发费用低、周期短和全民保健的优势。中药龙胆为龙胆科(Gentianaceae)植物，条叶龙胆(GentianamanshuricaKitag.)、龙胆(GentianascabraBunge.)、三花龙胆(Gentianatriflorapall.)或滇龙胆(GentianarigescensFranch.)的干燥根及根茎。前三种习称“龙胆”，后一种习称“坚龙胆”。条叶龙胆又名东北龙胆，分布于黑龙江、吉林、辽宁、山西、陕西、山东等省区；坚龙胆分布于云南、四川、贵州、湖南、广西等省区；三花龙胆分布于东北及华北地区、黑龙江、吉林、辽宁、内蒙古等省区。现代药理研究表明，龙胆具有保肝、利胆、健胃、降压、抗炎、抗过敏、抗病原体、增强免疫功能等多种药理活性，广泛地应用于临床。龙胆中含有裂环环烯醚萜类、环烯萜类化合物、生物碱、挥发油、多糖等成分。其中，多糖为龙胆有效成分之一，具有多种生物活性。王金宏报道龙胆中植物多糖具有一定的保肝作用、降血压功效及可增强小鼠的非特异性免疫功能和特异性体液免疫功能[王金宏.龙胆中植物多糖保肝、降血脂及免疫调节作用的研究[D].哈尔滨：哈尔滨商业大学,2012.]。王晨瑜在体内抗肿瘤研究中发现龙胆多糖含量为100mg/Kg时，抑瘤率较高，可达65.76％，由此说明龙胆多糖有明显的体内抗肿瘤活性[王晨瑜.龙胆多糖的制备及生物活性分析[D].抚顺：辽宁石油化工大学,2014.]。江蔚新、赵玺发现龙胆粗多糖具有抗凝血活性[江蔚新,赵玺.龙胆多糖的抗凝血作用的研究[J].黑龙江医药,2008(05):31-32.]。目前对龙胆多糖主要集中在提取及其他生物活性的研究，而对龙胆多糖的分离纯化报道较少，对其组分分子量的测定和抗凝血活性的研究却尚未报道。传统龙胆多糖的提取方法多为水提醇沉法，所得龙胆粗多糖往往含有蛋白质、色素、小分子可溶性物质等，这直接影响到产品的质量，所以粗多糖必须经过进一步的纯化，才能研究其抗凝血的作用机制。
技术实现思路
根据以上现有技术的不足，本专利技术提出一种龙胆酸性均一多糖及其提纯方法和应用，解决了现有龙胆多糖往往含有蛋白质、色素、小分子可溶性物质的难题，制得的龙胆酸性均一多糖纯度高，同时其抗凝血活性高，具有良好的抗凝血效果且安全无毒。为了实现上述目的，本专利技术采取的技术方案为：一种龙胆酸性均一多糖，包括如下组分的单糖及其摩尔百分含量：1-1.5％岩藻糖、11-12％鼠李糖、22-23％阿拉伯糖、17-18％半乳糖、3-3.5％葡萄糖、3-3.5％木糖、0.5-1％甘露糖、39-40％半乳糖醛酸。所述龙胆酸性均一多糖的提纯方法，该方法是将龙胆根原料除杂洗净干燥后粉碎，经热水浸提，旋蒸浓缩，乙醇沉淀，冷冻干燥后得到龙胆粗提物，龙胆粗提物经树脂脱蛋白、脱色，然后进行层析，先用蒸馏水洗脱，再用NaCl溶液阶段洗脱，收集NaCl洗脱液，真空浓缩后用蒸馏水透析，将其冻干得到龙胆酸性均一多糖。所述提纯方法具体包括以下步骤：步骤一，粉碎：将龙胆根除杂洗净后烘干、粉碎、过筛，得到龙胆粉末；步骤二，水提：将所述龙胆粉末与蒸馏水按料液的质量体积比1:15g/mL～1:35g/mL在60～100℃水浴条件下浸提1.5～3.5h，抽滤后，得到龙胆水提液；步骤三，浓缩：将所述龙胆水提液在40～65℃条件下真空浓缩得到浓缩液；所述的浓缩液是真空浓缩至原体积的20％，目的是为了减少乙醇的用量，减少后续的离心次数。步骤四，醇沉：在所述浓缩液中加入2～4倍体积无水乙醇搅拌后，在2～6℃下沉淀6～14h，离心收集沉淀，用无水乙醇洗涤沉淀2～5次，然后将沉淀加水复溶，去除无水乙醇，得到龙胆粗提物；步骤五，脱蛋白：将所述龙胆粗提物配制成0.5mg/mL～1.5mg/mL水溶液加入树脂后振摇，再抽滤将树脂和溶液分离，收集脱蛋白后的溶液加无水乙醇沉淀，并冷冻干燥，得到脱蛋白龙胆粗提物；步骤六，脱色：将步骤五得到的脱蛋白龙胆粗提物配制成2mg/mL～4mg/mL水溶液，调pH为5～7，加入大孔吸附树脂振揺，抽滤将树脂和溶液分离，收集脱色后溶液加入无水乙醇沉淀，经冷冻干燥后得到龙胆粗多糖；步骤七，层析：将步骤六得到的龙胆粗多糖溶于蒸馏水中，离心除去不溶物，所得溶液加入层析柱，先用蒸馏水洗脱，再用浓度逐渐增大的NaCl溶液阶段洗脱，流速为0.5mL/min～3mL/min，收集洗脱液，真空浓缩后透析2～4d，冻干得到龙胆酸性均一多糖。优选的，所述层析柱采用DEAE-SepharoseCL-6B阴离子交换柱。所述龙胆酸性均一多糖的重均分子量为5.8×104Da(道尔顿)。此为首次得到的此分子量的龙胆多糖组分(酸性多糖)，此分子量的龙胆酸性均一多糖具有较高的抗凝血活性。优选的，步骤二中所述龙胆粉末与蒸馏水按料液的质量体积比1:25g/mL进行浸提。此为料液的质量体积比单因素条件下进行的响应面优化设计。优选的，步骤五中所述树脂为聚酰胺。更优选的是，采用80目～100目聚酰胺。此树脂不仅可以除去龙胆多糖中大部分的游离蛋白质，而且使用该法具有多糖保留率高、成本低、对环境友好等优点。优选的，步骤六中所述大孔吸附树脂为AB-8大孔吸附树脂。此树脂脱色效果良好且保持了龙胆多糖的原始结构。优选的，步骤七中所述NaCl溶液阶段洗脱的NaCl浓度为0.1mol/L、0.2mol/L、0.5mol/L。能够较好的探寻出龙胆酸性多糖洗脱出来的浓度，在此NaCl浓度下主要得到0.1mol/L、0.2mol/L洗脱出来的龙胆酸性多糖。优选的，步骤七中所述收集洗脱液为收集0.2mol/L的NaCl溶液洗脱液。该NaCl浓度下得到的龙胆酸性多糖具有较高的抗凝血活性。相应的，本专利技术还提供了龙胆酸性均一多糖在功能性食品和医学上用于制备具有抗凝血作用的药物中的应用。本专利技术有益效果是：(1)本专利技术实现了对龙胆多糖的进一步分离纯化，获得了重均分子量为5.8×104Da的龙胆酸性均一多糖，经体外抗凝血活性实验证明该多糖组分具有良好的抗凝血效果。(2)本专利技术操作简单可行，能耗小，获得的龙胆酸性均一多糖抗凝血活性高，先利用水提醇沉法得到龙胆粗提物，再利用树脂法有效除去龙胆多糖中的蛋白质和色素，且保留了多糖的原始结构，避免了残留的化学试剂存在的安全隐患，再结合DEAE-SepharoseCL-6B阴离子交换柱的洗脱层析，进一步分离纯化得到高纯度的龙胆酸性均一多糖，可用于药品、保健营养品的原料或添加剂，如胶囊剂、片剂、口服液等。该多糖安全无毒，具本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种龙胆酸性均一多糖，包括如下组分的单糖及其摩尔百分含量：1‑1.5％岩藻糖、11‑12％鼠李糖、22‑23％阿拉伯糖、17‑18％半乳糖、3‑3.5％葡萄糖、3‑3.5％木糖、0.5‑1％甘露糖、39‑40％半乳糖醛酸。

【技术特征摘要】
1.一种龙胆酸性均一多糖，包括如下组分的单糖及其摩尔百分含量：1-1.5％岩藻糖、11-12％鼠李糖、22-23％阿拉伯糖、17-18％半乳糖、3-3.5％葡萄糖、3-3.5％木糖、0.5-1％甘露糖、39-40％半乳糖醛酸。2.根据权利要求1所述龙胆酸性均一多糖的制备方法，其特征在于，该方法是将龙胆根原料除杂洗净干燥后粉碎，经热水浸提，旋蒸浓缩，乙醇沉淀，冷冻干燥后得到龙胆粗提物，龙胆粗提物经树脂脱蛋白、脱色，然后进行层析，先用蒸馏水洗脱，再用NaCl溶液阶段洗脱，收集NaCl洗脱液，真空浓缩后用蒸馏水透析，将其冻干得到龙胆酸性均一多糖。3.根据权利要求2所述龙胆酸性均一多糖的制备方法，其特征在于，所述制备方法具体包括以下步骤：步骤一，粉碎：将龙胆根除杂洗净后烘干、粉碎，过筛，得到龙胆粉末；步骤二，水提：将所述龙胆粉末与蒸馏水按料液的质量体积比1:15g/mL～1:35g/mL在60～100℃水浴条件下浸提1.5～3.5h，抽滤后，得到龙胆水提液；步骤三，浓缩：将所述龙胆水提液在40～65℃条件下真空浓缩得到浓缩液；步骤四，醇沉：在所述浓缩液中加入2～4倍体积无水乙醇搅拌后，在2～6℃下沉淀6～14h，离心收集沉淀，用无水乙醇洗涤沉淀2～5次，然后将沉淀加水复溶，去除无水乙醇，得到龙胆粗提物；步骤五，脱蛋白：将所述龙胆粗提物配制成0.5mg/mL～1.5mg/mL水溶液加入树脂后振摇，再抽滤将树脂和溶液分离，收集脱蛋白后...

【专利技术属性】
技术研发人员：蔡为荣，许惠玲，
申请(专利权)人：安徽工程大学，
类型：发明
国别省市：安徽;34