一种新的鹿角海萝多糖制造技术

本发明专利技术公开了一种新的鹿角海萝多糖及其制备方法和应用。本发明专利技术首次通过水提醇沉法得到鹿角海萝粗多糖（CP），并经酶解、浓缩得到鹿角海萝精多糖（RP），最后经过DEAE Sephrose CL-6B和Sephadex G-100分离纯化得到鹿角海萝纯多糖（PP）。本发明专利技术所述的鹿角海萝多糖主要由葡萄糖（Glc）和半乳糖（Gal）组成，葡萄糖与半乳糖的摩尔比为1:1.86，重均相对平均分子量约为7.72E+04，具体结构为葡萄糖-6-硫酸基-β-D-半乳糖（l→4）-3，6-内醚-α-L-半乳糖（1→3）重复结构构成。本发明专利技术所述的鹿角海萝多糖具有很好的抗肿瘤活性，在制备抗肿瘤药物方面具有很好的应用前景。

【技术实现步骤摘要】
一种鹿角海萝多糖
本专利技术属于制药领域。更具体地，涉及一种鹿角海萝多糖及其制备方法和应用。
技术介绍
海藻多糖是一类混合物，是海藻细胞间和细胞内所含的各种高分子碳水化合物的总称，在海藻中含量丰富，约占干重的20～70%。依据来源海藻的不同，可分为褐藻多糖、红藻多糖、绿藻多糖等。越来越多的研究证明多糖具有复杂的多方面的生物活性和功能，特别是对机体免疫功能的作用。鹿角海萝（Gloiopeltisfurcata），红藻门（Rhodophyta）真红藻纲（Florideophyceae）隐丝藻目（Cryptonemiales）内枝藻科（Endocladiaceae）海萝属（GloipeltisJ.Agardh），俗名赤菜，为一年生红藻。国内外的科研工作者研究相继发现海萝多糖具有广泛的药理活性，是一种重要的海洋药物资源。例如，许实波等人研究表明海萝水提取物能延长小鼠常压耐缺氧存活时间、延长出血和血凝时间、提高体液免疫和细胞免疫功能、抗肿瘤；说明海萝提取物可望开发为保健食品，但进一步的药理研究还待进行。D.L.Ren研究结果表明，鹿角海萝多糖具有相似于PSK的抗肿瘤和免疫增强作用。该抗肿瘤作用可能与增加辅助T细胞、细胞毒性T细胞、NK细胞和增强DTH反应相关，它的免疫活性与抗肿瘤活性之间的关系有待进一步研究。汕头大学余杰等人用海萝多糖粗提物灌胃昆明种小鼠，观察海萝多糖粗提物（CP）对环磷酰胺诱发小鼠染色体突变和精子畸变的抑制作用和对荷S180肉瘤小鼠的抑瘤作用。实验结果显示，海萝多糖粗提物可使环磷酰胺诱发的小鼠骨髓嗜多染红细胞（PCE）微核率和精子畸形率明显降低，具有显著的抗突变作用，且呈现一定的剂量效应关系；海萝粗多糖对S180肉瘤也有明显的抑制作用，并有一定的剂量关系。其中，也建立H22实体肝癌肿瘤模型，以海萝多糖连续灌胃治疗，观察海萝多糖的抑瘤作用，并测定脾脏、胸腺和肝脏等器官的器官系数，分析血清抗H22抗体水平和谷丙转氛酶（GPT）及肝组织谷丙转氛酶（GPT）、谷草转氛酶（GOT）、丙二醛（MDA）水平以及超氧化物歧化酶（SOD）活性等生理生化指标，研究海萝多糖（GFP）对H22移植性肿瘤的抑瘤作用并探讨其抗种瘤机理。结果显示，海萝多糖200和400mg·kg-1·d-1灌胃7d，使给药组抑瘤率分别达到35.64%（P<0.01）和36.63%（P<0.01），海萝多糖具有一定的抗移植性小鼠H22肝肿瘤作用。其抗肿瘤的机理可能是通过增强机体的特异性免疫、增加血清抗肿瘤抗体水平和增强机体清除自由基的能力来实现；同时还发现海萝多糖具有保护荷瘤小鼠肝脏的作用。近年来多糖类物质的研究取得了很大的进展，但与蛋白质、核酸的研究相比还有很大差距，并且不够深入，主要有以下方面的问题：多糖的构效关系不明确，现已初步认为多糖的生物活性与其一级结构、高级结构、分子量、溶解度等有关，但缺乏规律性的科学依据和结论，大多还是推测和分析，而对多糖的溶液构象和晶体研究几乎是空白。对多糖在体内的作用机制研究不够深入，有关多糖在体内代谢的研究甚少，还不十分明确多糖在体内代谢的途径。多糖的多种生物活性虽已被实验所证实，但多糖在生物体内真正的作用机制还未阐明，多糖在细胞膜或脂质体表面的构象和作用、多糖和磷脂及蛋白缔合的化学和物理进程及它们所形成的微环境与它们的生物功能之间的关系等都还不十分清楚，有待进一步深入研究。更主要的原因在于，多糖的制备、结构测定和合成较为困难，由于多糖不是一个单一物质，而是有一定分子量分布的混合物，很难得到其晶体；多糖的一级结构随着单糖种类、糖苷类型、构象、分枝度、取代基的不同而有很大的变化，使一级结构的测定有很大的困难，而多糖的高级结构更为复杂；这些因素使多糖在发挥作用时的构象研究、多糖的合成等方面造成了很大的困难。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题是克服现有海萝藻多糖及其结构研究的技术不足，提供一种新的鹿角海萝多糖，公开了鹿角海萝多糖的结构组成及其制备方法。本专利技术另一目的是提供鹿角海萝多糖在抗肿瘤方面的应用。本专利技术上述目的通过以下技术方案实现：本专利技术公开了一种新的鹿角海萝多糖，所述鹿角海萝多糖的重均相对平均分子量为7.72E+04，且由葡萄糖-6-硫酸基-β-D-半乳糖（l→4）-3，6-内醚-α-L-半乳糖（1→3）重复结构构成。所述的鹿角海萝多糖中葡萄糖和半乳糖的摩尔比为1:1.86。本专利技术上述鹿角海萝多糖是由如下方法制备得到：S1.用乙醇对鹿角海萝干粉进行脱脂除色后，油浴4h；再用无水乙醇处理过夜后，沉淀依次用无水乙醇、丙酮、无水乙醚洗涤，烘干得鹿角海萝粗多糖；S2.鹿角海萝粗多糖经木瓜蛋白酶酶解后，加入三氯乙酸过夜，去沉淀，中和，透析，浓缩，干燥得鹿角海萝精多糖；S3.用DEAE-琼脂糖凝胶柱和G-100凝胶柱层析，对鹿角海萝精多糖分离提纯得鹿角海萝纯多糖，即权利要求1所述鹿角海萝多糖。具体地，所述鹿角海萝多糖是由如下方法制备得到：S1.提取鹿角海萝粗多糖：S11.取鹿角海萝干粉，加入15～20倍体积的70～80v/v%乙醇进行脱脂除色，加热，控制温度在70～90℃，料液比为1:40～1:60条件下油浴4h：S12.将S11得到的溶液离心，上清液浓缩后，加入3～4倍体积的无水乙醇，4～6℃放置过夜；S13.将S12得到的溶液离心，沉淀依次用无水乙醇、丙酮、无水乙醚洗涤，烘干，得鹿角海萝粗多糖（CP）；S2.获得鹿角海萝精多糖：S21.鹿角海萝粗多糖经木瓜蛋白酶酶解后，加入三氯乙酸，4～6℃过夜，去沉淀；S22.将S21去沉淀后的溶液加碱中和，透析，浓缩透析液，冷冻干燥，得灰白色网状的鹿角海萝精多糖（RP）；S3.分离纯化鹿角海萝纯多糖：S31.将鹿角海萝精多糖上DEAE-琼脂糖凝胶柱，水洗、盐洗、浓缩、除盐、干燥，经G-100凝胶柱层析，检测收集得到纯多糖流份；S32.浓缩、冷冻干燥，得鹿角海萝纯多糖（PP），即权利要求1所述鹿角海萝多糖。其中，优选地，步骤S12所述离心为1500～3000rpm离心10～15min；步骤S12所述浓缩是在50～60℃条件下，将上清液浓缩至原体积的1/5～1/6；步骤S13所述离心为3000～4000rpm离心10～15min；步骤S13所述烘干为50～60℃烘干至无乙醚味。优选地，步骤S21所述酶解是在pH6.8～7.0条件下，使用终浓度为1～1.5w/v%的木瓜蛋白酶，50～60℃酶解反应2～3h，再升温至90～100℃后终止反应。优选地，步骤S21所述三氯乙酸的体积浓度为4～5%，三氯乙酸与鹿角海萝粗多糖溶液的体积比为1:1～1:1.2；步骤S22所述浓缩为50～60℃浓缩至原液体积的1/15～1/16。另外，更具体地，步骤S2的具体操作条件为：按照鹿角海萝粗多糖与蒸馏水质量体积比为1～2：100～200g/mL的比例，将取鹿角海萝粗多糖（CP）全部溶于蒸馏水中，加入终浓度为1～1.5w/v%的木瓜蛋白酶，控制酶解温度为50～60℃，溶液的pH为6.8～7.0，酶解2～3h后升高温度至90～100℃后终止反应；按照1:1～1:1.2的体积比，在上述反应后的溶液中加入三氯乙酸，搅拌均匀，4～6℃过夜，去沉淀，加入2～4mol/LNaOH中和，透析，本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种鹿角海萝多糖，其特征在于，所述鹿角海萝多糖的重均相对平均分子量为7.72E+04，且由葡萄糖‑6‑硫酸基‑β‑D‑半乳糖（l→4）‑3，6‑内醚‑α‑L‑半乳糖（1→3）重复结构构成。

【技术特征摘要】
1.一种鹿角海萝多糖，其特征在于，所述鹿角海萝多糖的重均相对平均分子量为7.72E+04，且由葡萄糖-6-硫酸基-β-D-半乳糖（l→4）-3，6-内醚-α-L-半乳糖（1→3）重复结构构成；所述鹿角海萝多糖中葡萄糖与半乳糖的摩尔比为1：1.86。2.根据权利要求1所述鹿角海萝多糖，其特征在于，由如下方法制备得到：S1.提取鹿角海萝粗多糖：S11.取鹿角海萝干粉，加入乙醇进行脱脂除色，控制温度在70～90℃，料液比为1：40～1：60条件下油浴4h；S12.将S11得到的溶液离心，上清液浓缩后加入无水乙醇，4～6℃放置过夜；S13.将S12得到的溶液离心，沉淀依次用无水乙醇、丙酮、无水乙醚洗涤，烘干，得鹿角海萝粗多糖；S2.分离鹿角海萝精多糖：S21.鹿角海萝粗多糖经木瓜蛋白酶酶解后，加入三氯乙酸4～6℃过夜，去沉淀；S22.将S21得到的溶液加碱中和，透析，浓缩，干燥，得鹿角海萝精多糖；S3.纯化鹿角海萝纯多糖：S31.将鹿角海萝精多糖上DEAE-琼脂糖凝胶柱，水洗、盐洗、浓缩、除盐、干燥，经G-100凝胶柱层析，检测收集纯多糖流份；S32.将S31收集的纯多糖流份浓缩、干燥，得鹿角海萝纯多糖，即权利要求1所述鹿角海萝多糖。3.根据权利要求2所述鹿角海萝多糖，其特征在于，步骤S11所述乙醇的浓度为70～80v/v%，用量为鹿角海萝干粉体积的15～20倍；所述油浴是使用硅油；步骤S12所述离心为1500～3000rpm离心10～15min，所述无水乙醇的用量为浓缩后上清液体积的3～4倍；步骤S12所述浓缩是在50～60℃条件下，将上清液浓缩至原体积的1/5～1/6；步骤S13所述离心为3000～4000rpm离心10～15min；步骤S13所述烘干为50～60℃烘干至无乙醚味。4.根据权利要求2所述鹿角海萝多糖，其特征在于，步骤S21所述...

【专利技术属性】
技术研发人员：石刚刚，陈一村，江泽斌，郑娇娇，
申请(专利权)人：汕头大学医学院，
类型：发明
国别省市：广东;44