一种曲霉菌的化学发光检测试剂盒及其应用制造技术

本发明专利技术提供了一种曲霉菌的化学发光检测试剂盒及其应用，所述试剂盒包括捕获抗体和信号抗体，所述捕获抗体和所述信号抗体为抗曲霉菌半乳甘露聚糖的单克隆抗体，所述单克隆抗体的重链可变区包括如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列；所述单克隆抗体的轻链可变区包括如SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列。本发明专利技术的抗曲霉菌半乳甘露聚糖的单克隆抗体为兔源单克隆抗体，特异性好、稳定性好，与曲霉菌半乳甘露聚糖的亲和力强，可以快速与曲霉菌半乳甘露聚糖进行结合，缩短了检测时间；在进行半乳甘露聚糖的检测过程中，通过调整试剂的添加顺序，克服了待测样本中的生物素对结果造成的干扰。

A chemiluminescence detection kit for Aspergillus and its application

【技术实现步骤摘要】
一种曲霉菌的化学发光检测试剂盒及其应用
本专利技术属于体外诊断
，涉及一种曲霉菌的化学发光检测试剂盒及其应用。
技术介绍
侵袭性真菌病(invasivefungaldisease，IFD)指真菌侵入人体后，在组织、器官或血液中生长繁殖，导致炎症反应和组织损伤的感染性疾病。近年来由于抗生素的滥用，侵袭性曲霉病(invasiveaspergillosis，IA)的发病率逐年升高，临床表现为咳嗽、咳痰、咯血、胸痛和呼吸困难等肺部感染症状，慢性阻塞性肺病、AIDS、粒细胞缺乏、器官移植和血液病/恶性肿瘤患者是侵袭性曲霉病的高危人群。其中，IA在血液病和造血干细胞移植(hematopoieticstemcelltransplants，HSCT)患者中的死亡率高达70％～90％，造成高死亡率的主要原因在于不能在病程早期对IA进行检测诊断，以至患者得不到及时有效的治疗，因此，对IA进行早期诊断具有重要的意义。半乳甘露聚糖(Galactomannan，GM)是曲霉菌细胞壁的主要成分，被认为是感染曲霉后最早释放入血的标志性抗原，释放量与菌体量成正比，可以反映曲霉的感染程度。目前，GM试验是侵袭性曲霉感染的早期诊断方法，已被国内外专家共识并被指南推荐。侵袭性肺曲霉病的临床诊断方法主要包括影像学检查、组织病理学检查、培养及镜检、血清G试验/GM试验和分子生物学检测方法。截至2019年1月，针对曲霉的检测产品已有多种，具有代表性的产品如表1所示。目前，曲霉检测的主要方法为免疫分析方法，但是存在检测时间长、准确性低的问题；分子诊断技术由于受到检测环境和样本前处理步骤的影响，对结果的准确性具有一定的干扰，应用范围有限；胶体金法具有检测时间短的优势，但是存在检测限高、灵敏度差、诊断结果依赖肉眼判断的缺陷。表1曲霉检测现有的部分产品信息化学发光免疫技术由于具有高灵敏度、检测时间短和自动化等特点，逐渐应用于曲霉菌的检测。然而现有的化学发光诊断试剂盒，为了缩短反应时间，大多采用一步法操作，由于生物素标记抗体与样品和亲和素磁珠同时进行反应，样品中的生物素必然会干扰生物素标记抗体与亲和素磁珠的结合，影响结果的准确性。因此，有必要提供一种新的化学发光检测试剂盒，应用于曲霉检测领域。
技术实现思路
针对现有技术的不足和实际需求，本专利技术提供了一种曲霉菌的化学发光检测试剂盒及其应用，所述试剂盒具有检测速度快、灵敏度高、准确性好、自动化程度高的优势，有利于为侵袭性曲霉病的快速临床诊断提供有力依据。为达此目的，本专利技术采用以下技术方案：第一方面，本专利技术提供了一种曲霉菌的化学发光检测试剂盒，所述试剂盒包括捕获抗体和信号抗体，所述捕获抗体和所述信号抗体为抗曲霉菌半乳甘露聚糖的单克隆抗体，所述单克隆抗体的重链可变区包括如SEQIDNO:1所示的氨基酸序列；所述单克隆抗体的轻链可变区包括如SEQIDNO:2所示的氨基酸序列；SEQIDNO:1：METGLRWLLLVAVLKGVQCQSVEEVSGFSLSSYITNYYYVRQAPGKSGGRLTGLEYIGMISGANTGYANWTSPTTEDTANGRFDMNWVTYVTPGTPLTLTCFCARTISKTSTTVDLKMYGMDLWGPGTLVTVSS；SEQIDNO:2：MDTRAPTQLLGLLLLWLPGATFAIVMTQSEACAGYKYTGTWYQFTLTISDGSVPVCDQDAATYYTPSSTIDSQKPGSTLASGVPSRFKGSGSGTQVGDTVPPKLLIYQSVYSNNRLANCQAVIAFGGGTEVVVK。本专利技术中，所述抗曲霉菌半乳甘露聚糖的单克隆抗体为兔源单克隆抗体，特异性好、稳定性好，解离常数相对于鼠源单克隆抗体小，与曲霉菌半乳甘露聚糖的亲和力强，可以快速与曲霉菌半乳甘露聚糖进行结合，有利于缩短检测时间。优选地，所述捕获抗体上修饰有生物素或荧光基团。优选地，所述荧光基团包括FITC、ALEX-350、AlexaFluor488、Cy3、Cy5、FAM、VIC、TET、JOE、HEX或ROX中的任意一种或至少两种的组合，优选为FITC。优选地，所述捕获抗体的浓度为0.5～3μg/mL，例如可以是0.5μg/mL、1μg/mL、1.5μg/mL、2μg/mL、3.5μg/mL或3μg/mL。优选地，所述信号抗体上修饰有化学发光基团。优选地，所述化学发光基团包括吖啶酯、鲁米诺、(金钢烷)-1,2-二氧乙烷或碱性磷酸酶中的任意一种或至少两种的组合，优选为吖啶酯。优选地，所述信号抗体的浓度为0.5～3μg/mL，例如可以是0.5μg/mL、1μg/mL、1.5μg/mL、2μg/mL、3.5μg/mL或3μg/mL。优选地，所述试剂盒还包括固相载体。优选地，所述固相载体包括磁微粒、酶标板、微球、亲和膜或液相芯片中的任意一种或至少两种的组合，优选为磁微粒。优选地，所述固相载体表面修饰有链霉亲和素和/或荧光基团的特异性抗体。本专利技术中，采用捕获抗体和固相载体的连接方式包括生物素-链霉亲和素、荧光基团-荧光基团抗体，当采用荧光基团-荧光基团抗体连接捕获抗体和固相载体时，彻底消除了待测样本中的生物素对结果造成的干扰。优选地，所述磁微粒的浓度为100～1000μg/mL，例如可以是100μg/mL、200μg/mL、300μg/mL、400μg/mL、500μg/mL、600μg/mL、700μg/mL、800μg/mL、900μg/mL或1000μg/mL。优选地，所述试剂盒还包括校准品，所述校准品为曲霉菌半乳甘露聚糖。优选地，所述校准品的浓度分别为0.2～25.0ng/mL，例如可以是0.2ng/mL、1ng/mL、2ng/mL、3ng/mL、4ng/mL、5ng/mL、6ng/mL、7ng/mL、8ng/mL、9ng/mL、10ng/mL、11ng/mL、12ng/mL、13ng/mL、14ng/mL、15ng/mL、16ng/mL、17ng/mL、18ng/mL、19ng/mL、20ng/mL、21ng/mL、22ng/mL、23ng/mL、24ng/mL或25ng/mL，优选为0.2～1.0ng/mL或5.0～25.0ng/mL。第二方面，本专利技术提供了一种半乳甘露聚糖的检测方法，所述检测方法采用如第一方面所述的试剂盒。优选地，所述检测方法包括抗原结合的步骤；优选地，所述抗原结合的步骤包括(a)～(c)中的任意一种；(a)将生物素标记捕获抗体和链霉亲和素标记固相载体共孵育，加入待测样本和信号抗体，混合孵育后去上清；(b)将待测样本采用链霉亲和素标记固相载体进行预处理，去除待测样本中的生物素；加入生物素标记捕获抗体、链霉亲和素标记固相载体和信号抗体，混合孵育后去上清；(c)向待测样本中加入FITC标记捕获抗体、信号抗体、FITC抗体标记固相载体，混合孵育本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种曲霉菌的化学发光检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括捕获抗体和信号抗体，所述捕获抗体和所述信号抗体为抗曲霉菌半乳甘露聚糖的单克隆抗体，所述单克隆抗体的重链可变区包括如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列；/n所述单克隆抗体的轻链可变区包括如SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列。/n

【技术特征摘要】
1.一种曲霉菌的化学发光检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括捕获抗体和信号抗体，所述捕获抗体和所述信号抗体为抗曲霉菌半乳甘露聚糖的单克隆抗体，所述单克隆抗体的重链可变区包括如SEQIDNO:1所示的氨基酸序列；
所述单克隆抗体的轻链可变区包括如SEQIDNO:2所示的氨基酸序列。


2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述捕获抗体上修饰有生物素或荧光基团；
优选地，所述荧光基团包括FITC、ALEX-350、AlexaFluor488、Cy3、Cy5、FAM、VIC、TET、JOE、HEX或ROX中的任意一种或至少两种的组合，优选为FITC；
优选地，所述捕获抗体的浓度为0.5～3μg/mL。


3.根据权利要求1或2所述的试剂盒，其特征在于，所述信号抗体上修饰有化学发光基团；
优选地，所述化学发光基团包括吖啶酯、鲁米诺、(金钢烷)-1,2-二氧乙烷或碱性磷酸酶中的任意一种或至少两种的组合，优选为吖啶酯；
优选地，所述信号抗体的浓度为0.5～3μg/mL。


4.根据权利要求1-3任一项所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括固相载体；
优选地，所述固相载体包括磁微粒、酶标板、微球、亲和膜或液相芯片中的任意一种或至少两种的组合，优选为磁微粒；
优选地，所述固相载体表面修饰有链霉亲和素和/或荧光基团的特异性抗体；
优选地，所述磁微粒的浓度为100～1000μg/mL。


5.根据权利要求1-4任一项所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括校准品，所述校准品为...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘春龙，张舟，翟栓柱，付成华，盛长忠，周泽奇，粟艳，
申请(专利权)人：丹娜天津生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：天津;12