一种高通量超灵敏荧光金纳米簇免疫层析试纸条及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种高通量超灵敏荧光金纳米簇免疫层析试纸条及其应用。该荧光金纳米簇免疫层析试纸条包括样本垫、硝酸纤维素膜、吸水纸以及PVC粘性底板。所述硝酸纤维素膜上包被有两条目标物检测线和一条质控线。本发明专利技术还公开了成套荧光金纳米簇偶联抗体探针，是由链霉亲和素化的荧光金纳米簇标记的生物素化的抗小分子化合物A的抗体和链霉亲和素化的荧光金纳米簇标记的生物素化的抗小分子化合物B的抗体组成。所述荧光金纳米簇是以6‑氮杂‑2‑硫代胸腺嘧啶和精氨酸为配体的超强荧光的绿色荧光金纳米簇。本发明专利技术优点是方法简单快速、结果直观准确、可定量/半定量检测，能够实现兽药残留的高通量超灵敏在线检测。

A high flux ultra sensitive fluorescent gold nanocluster immunochromatographic strip and its application

【技术实现步骤摘要】
一种高通量超灵敏荧光金纳米簇免疫层析试纸条及其应用
本专利技术属于食品安全中兽药检测领域，具体涉及一种高通量超灵敏荧光金纳米簇免疫层析试纸条及其应用。
技术介绍
免疫层析技术是出现于80年代初期的一种独特的免疫分析方式，它具有快速简单、灵敏便捷、价格低廉等优点，可以实现目标物的在线快速检测和监控，目前在食品安全、医学诊断、环境监测等领域得到了广泛的应用。基于胶体金为标记物的免疫层析技术是运用最成功最广泛的一种快速筛查手段，但是其灵敏度往往很难满足人们的要求。因此，建立一种高通量超灵敏同时检测一个样品中多种目标物残留的免疫层析方法是十分必要的。荧光金纳米簇是近几年出现的一种新型荧光纳米材料，它是由几个到几百个原子组成的粒径为0.2-3nm的以金属为核、有机配体为壳的核壳型结构，由于其粒径接近于电子的费米波长，性质介于单原子和较大的纳米粒子或大体积的贵金属之间。在一定程度上，荧光金纳米簇有效克服了传统荧光纳米材料的缺点，具有光致发光性能强、光稳定性良好、斯托克斯位移大和生物相容性好等优点。但是目前广泛应用研究的荧光金纳米簇是以牛血清白蛋白为配体合成的，荧光量子产率都较低(<10％)，很难将其作为标记物用于免疫快速检测技术中。而以6-氮杂-2-硫代胸腺嘧啶为配体，精氨酸为刚化剂合成的荧光金纳米簇(Arg-ATT-AuNCs)有超强的绿色荧光，同时具有水溶性好、稳定性高、单分散性好、荧光量子产率高等优点，表面大量的羧基易于和蛋白进行偶联。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题是如何同时简便、快速、高灵敏的检测两种不同的化合物。为了解决上述技术问题，本专利技术首先提供了一种试剂盒。本专利技术提供的试剂盒包括荧光免疫层析试纸条和成套荧光金纳米簇偶联抗体探针；所述成套荧光金纳米簇偶联抗体探针由链霉亲和素化的荧光金纳米簇标记的生物素化的抗小分子化合物A的抗体和链霉亲和素化的荧光金纳米簇标记的生物素化的抗小分子化合物B的抗体组成；所述荧光免疫层析试纸条由依次连接并固定于基底层上的样品垫、设有检测线T1、检测线T2和质控线的包被膜，以及吸水垫组成；所述检测线T1、所述检测线T2和所述质控线相互分离；所述检测线T1处包被有小分子化合物A抗原；所述抗小分子化合物A的抗体能够特异性结合小分子化合物A抗原；所述检测线T2处包被有小分子化合物B抗原；所述抗小分子化合物B的抗体能够特异结合小分子化合物B抗原；所述质控线处包被有抗所述抗小分子化合物A的抗体和所述抗小分子化合物B的抗体的抗体；所述检测线T1位于所述包被膜靠近所述样品垫的一端；所述质控线位于所述包被膜靠近所述吸水垫的一端。上述试剂盒中，所述荧光金纳米簇是以6-氮杂-2-硫代胸腺嘧啶为配体、精氨酸为刚化剂合成的荧光纳米颗粒；该荧光纳米颗粒是水溶性表面，具有大量羧基的核壳型绿色荧光纳米颗粒，合成方法简单、绿色无污染。所述链霉亲和素化的荧光金纳米簇是通过活泼酯法将链霉亲和素的氨基与荧光金纳米簇表面的羧基偶联得到的偶联物；所述链霉亲和素化的荧光金纳米簇标记的生物素化的抗小分子化合物A的抗体是利用生物素与链霉亲和素的特异性识别能力将链霉亲和素化的荧光金纳米簇与生物素化的抗小分子化合物A的抗体偶联形成的偶联物；所述链霉亲和素化的荧光金纳米簇标记的生物素化的抗小分子化合物B的抗体是利用生物素与链霉亲和素的特异性识别能力将链霉亲和素化的荧光金纳米簇与生物素化的抗小分子化合物B的抗体偶联形成的偶联物。本专利技术的成套荧光金纳米簇偶联抗体探针可于96孔板单个孔中干燥密封保存，检测时用样品复溶。进一步的，所述荧光金纳米簇的制备方法如下：a1)用氢氧化钠水溶液将6-氮杂-2-硫代胸腺嘧啶溶解至终浓度为80mM；然后将其加入到氯金酸溶液中，室温下避光反应1～2小时，得到弱发光荧光金纳米簇；再通过超滤除去未反应的小分子，并用超纯水重悬至原体积，得到弱发光荧光金纳米簇体系。a2)将精氨酸溶液加入所述弱发光荧光金纳米簇体系中，在37℃环境中避光反应24～26小时，得到超强发光的绿色荧光金纳米簇溶液。本专利技术制备的荧光金纳米簇的结构示意图如图1所示。该荧光金纳米簇的制备方法参见文献：FabricationofWater-Soluble,Green-EmittingGoldNanoclusterswitha65％PhotoluminescenceQuantumYieldviaHost–GuestRecognition,DengHH,ShiXQ,WangFF,etal.ChemistryofMaterials,2017,29中的方法。所述成套荧光金纳米簇偶联抗体探针的制备方法如下：b1)链霉亲和素化Arg-ATT-AuNCs的制备：b1-1)将荧光金纳米簇溶液、Tris-HCl(pH8.0)和链霉亲和素溶液混匀，得到混合液。b1-2)取EDC溶液和NHSS溶液加入所述混合液中，于室温下避光搅拌反应2小时，得到反应后溶液。b1-3)向所述反应后溶液中加入BSA溶液封闭30min；得到封闭后溶液；然后将封闭后溶液用超滤管超滤5min，上清用Tris-HCl(pH8.0)重悬至1ml，得到链霉亲和素化Arg-ATT-AuNCs溶液。b2)生物素化抗体的制备：b2-1)在碳酸氢钠溶液中加入生物素溶液和盐酸克伦特罗单克隆抗体溶液，然后在室温下振荡反应2.5小时。反应完成后，用透析袋进行纯化，得到生物素化的盐酸克伦特罗单克隆抗体溶液。b2-2)在碳酸氢钠溶液中加入生物素溶液和莱克多巴胺单克隆抗体溶液，然后在室温下振荡反应2.5小时。反应完成后，用透析袋进行纯化，得到莱克多巴胺单克隆抗体溶液。b3)荧光检测探针的制备：取链霉亲和素化Arg-ATT-AuNCs溶液，同时加入生物素化的盐酸克伦特罗单克隆抗体溶液和生物素化的莱克多巴胺单抗溶液，室温反应30min，得到本专利技术的荧光检测探针溶液。该溶液中含有链霉亲和素化Arg-ATT-AuNCs与生物素化盐酸克伦特罗单克隆抗体形成的偶联物及链霉亲和素化Arg-ATT-AuNCs与生物素化莱克多巴胺单克隆抗体形成的偶联物。上述试剂盒中，所述抗小分子化合物A的抗体为抗小分子化合物A的多克隆抗体或单克隆抗体；所述抗小分子化合物B的抗体为抗小分子化合物B的多克隆抗体或单克隆抗体。所述检测线T1包被有小分子化合物A与BSA载体蛋白的偶联物；所述检测线T2包被有小分子化合物B与BSA载体蛋白的偶联物。上述试剂盒中，所述荧光金纳米簇的粒径为1.8-2.2nm；所述抗小分子化合物A的抗体为抗小分子化合物A的单克隆抗体；所述抗小分子化合物B的抗体为抗小分子化合物B的单克隆抗体；所述质控线处包被有羊抗鼠IgG。上述试剂盒中，所述基底层的材料为聚氯乙烯；所述样品垫为玻璃纤维素膜；所述包被膜为硝酸纤维素膜；所述检测线T1与所述检测线T2之间的距离为3mm；所述检本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种试剂盒，其包括试纸条和成套荧光金纳米簇偶联抗体探针；/n所述成套荧光金纳米簇偶联抗体探针由链霉亲和素化的荧光金纳米簇标记的生物素化的抗小分子化合物A的抗体和链霉亲和素化的荧光金纳米簇标记的生物素化的抗小分子化合物B的抗体组成；/n所述试纸条由依次连接并固定于基底层上的样品垫、设有检测线T1、检测线T2和质控线的包被膜，以及吸水垫组成；/n所述检测线T1、所述检测线T2和所述质控线相互分离；/n所述检测线T1处包被有小分子化合物A抗原；所述抗小分子化合物A的抗体能够特异性结合小分子化合物A抗原；/n所述检测线T2处包被有小分子化合物B抗原；所述抗小分子化合物B的抗体能够特异结合小分子化合物B抗原；/n所述质控线处包被有抗所述抗小分子化合物A的抗体和所述抗小分子化合物B的抗体的抗体；/n所述检测线T1位于所述包被膜靠近所述样品垫的一端；/n所述质控线位于所述包被膜靠近所述吸水垫的一端。/n

【技术特征摘要】
1.一种试剂盒，其包括试纸条和成套荧光金纳米簇偶联抗体探针；
所述成套荧光金纳米簇偶联抗体探针由链霉亲和素化的荧光金纳米簇标记的生物素化的抗小分子化合物A的抗体和链霉亲和素化的荧光金纳米簇标记的生物素化的抗小分子化合物B的抗体组成；
所述试纸条由依次连接并固定于基底层上的样品垫、设有检测线T1、检测线T2和质控线的包被膜，以及吸水垫组成；
所述检测线T1、所述检测线T2和所述质控线相互分离；
所述检测线T1处包被有小分子化合物A抗原；所述抗小分子化合物A的抗体能够特异性结合小分子化合物A抗原；
所述检测线T2处包被有小分子化合物B抗原；所述抗小分子化合物B的抗体能够特异结合小分子化合物B抗原；
所述质控线处包被有抗所述抗小分子化合物A的抗体和所述抗小分子化合物B的抗体的抗体；
所述检测线T1位于所述包被膜靠近所述样品垫的一端；
所述质控线位于所述包被膜靠近所述吸水垫的一端。


2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：
所述荧光金纳米簇是以6-氮杂-2-硫代胸腺嘧啶为配体、精氨酸为刚化剂合成的荧光纳米颗粒；
或，所述链霉亲和素化的荧光金纳米簇是通过活泼酯法将链霉亲和素的氨基与荧光金纳米簇表面的羧基偶联得到的偶联物；
或，所述链霉亲和素化的荧光金纳米簇标记的生物素化的抗小分子化合物A的抗体是利用生物素与链霉亲和素的特异性识别能力将链霉亲和素化的荧光金纳米簇与生物素化的抗小分子化合物A的抗体偶联形成的偶联物；
或，所述链霉亲和素化的荧光金纳米簇标记的生物素化的抗小分子化合物B的抗体是利用生物素与链霉亲和素的特异性识别能力将链霉亲和素化的荧光金纳米簇与生物素化的抗小分子化合物B的抗体偶联形成的偶联物。


3.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：
所述抗小分子化合物A的抗体为抗小分子化合物A的多克隆抗体或单克隆抗体；
或，所述抗小分子化合物B的抗体为抗小分子化合物B的多克隆抗体或单克隆抗体。


4.根据权利要求1-3任一所述的试剂盒，其特征在于：
所述荧光金纳米簇的粒径为1.8-2.2nm；
或，所述抗小分子化合物A的抗体为抗小分子化合物A的单克隆抗体；
或，所述抗小分子化合物B的抗体为抗小分子化合物B的单克隆抗体；
或，所述质控线处包被有羊抗鼠IgG。


5.根据权利要求1-4任一所述的试剂盒，其特征在于：
所述基底层的材料为聚氯乙烯；
或，所述样品垫为玻璃纤维素膜；
或，所述包被膜为硝酸纤维素膜；
或，所述检测线T1与所述检测线T2之间的距离为3mm；
或，所述检测线T2与所述质控线之间的距离为3mm。


6.根据权利要求1-5任一所述的试剂盒，其特征在于：
所述小分子化合物A和所述小分子化合物B均为兽药残留分子；
或，所述小分子化合物A为盐酸克伦特罗；
或，所述小分子化合物B为莱克多巴胺。


7.权利要求1-6任一所述的试剂盒的制备方法，包括如下步骤：分别制备权利要求1-6任一所述的试剂盒中的试纸条和成套荧光金纳米簇偶联抗体探针；
制备所述试纸条的方法包括如下步骤：
I、分别制备所述样品垫、所述设有检测线T1、检测线T2和质控线的包被膜，以及所述吸水垫；

【专利技术属性】
技术研发人员：江海洋，沈建忠，王战辉，温凯，彭涛，郑丕苗，
申请(专利权)人：中国农业大学，
类型：发明
国别省市：北京;11