用于检测赭曲霉毒素A的荧光探针与成套试剂制造技术

本发明专利技术公开了用于检测赭曲霉毒素A的荧光探针与成套试剂。本发明专利技术公开的用于检测赭曲霉毒素A的荧光探针由四甲基罗丹明荧光染料分子标记赭曲霉毒素A得到，用于检测赭曲霉毒素A的成套试剂由用于检测赭曲霉毒素A的荧光探针与赭曲霉毒素A抗体组成。实验证明，利用本发明专利技术的用于检测赭曲霉毒素A的荧光探针以及由其与赭曲霉毒素A抗体组成的成套试剂可以成功检测赭曲霉毒素A，对赭曲霉毒素A检测限为1‑2500nM，并可以成功从赭曲霉毒素A，赭曲霉毒素B，伏马毒素B1，伏马毒素B2，玉米赤霉烯酮和黄曲霉毒素B1中检测到赭曲霉毒素A，检测范围宽，灵敏度高，且操作简单，检测时间短，具有广泛的应用前景。

Fluorescent probe and kit for detection of ochratoxin A

【技术实现步骤摘要】
用于检测赭曲霉毒素A的荧光探针与成套试剂
本专利技术涉及分析检测领域中，用于检测赭曲霉毒素A的荧光探针与成套试剂。
技术介绍
赭曲霉毒素A(OchratoxinA，OTA)是一种典型的真菌毒素分子，由曲霉和青霉等真菌产生的有毒化合物。赭曲霉毒素A可造成多种谷物、坚果、水果等食品的污染，污染分布广泛。赭曲霉毒素A具有肾毒性、肝毒性和免疫毒性等，而且具有致癌性，因此摄入赭曲霉毒素A污染的食品对健康造成很到的威胁。农产品和多种食品中所允许的赭曲霉毒素A的含量有很严格的限制。灵敏检测赭曲霉毒素A对于食品安全、环境保护和维护身体健康都具有重要的意义。发展快速灵敏检测赭曲霉毒素A在赭曲霉毒素A的快速筛查方面有很大需求，采用免疫抗体等的生物传感分析方法，可克服常规大型仪器监测分析方法如色谱法和质谱法等在检测时间长、检测成本高、操作复杂等局限性。荧光分析方法具有很高的灵敏度、同时操作简单、检测所需时间短，因而荧光分析方法在快速灵敏检测赭曲霉毒素A方面显示出优势。免疫抗体能选择性地与目标分子结合，是常用的亲和配体，在检测赭曲霉毒素A方面具有很广的应用，如酶联分析等，但酶联分析相对来说仍需要多个检测步骤，检测时间较长。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种新型的荧光标记赭曲霉毒素A的荧光探针及用于检测赭曲霉毒素A的成套试剂。本专利技术提供的用于检测赭曲霉毒素A的成套试剂，记为成套试剂1，所述成套试剂1由赭曲霉毒素A荧光探针和赭曲霉毒素A抗体组成；所述赭曲霉毒素A荧光探针由四甲基罗丹明荧光染料分子标记赭曲霉毒素A得到。所述成套试剂1中，所述赭曲霉毒素A荧光探针可按照包括如下步骤的方法制备得到：将赭曲霉毒素A、N-羟基琥珀酰亚胺、N-(3-二甲氨基丙基)-N'-乙基碳二亚胺盐酸盐与N,N-二甲基甲酰胺反应，然后加入带有氨基基团标记的四甲基罗丹明荧光染料分子衍生物进行反应,得到反应产物，从所述反应产物中分离得到所述赭曲霉毒素A荧光探针。所述赭曲霉毒素A荧光探针的制备步骤中，赭曲霉毒素A、N-羟基琥珀酰亚胺、N-(3-二甲氨基丙基)-N'-乙基碳二亚胺盐酸盐与N,N-二甲基甲酰胺的配比可为1mg：1mg：1.3mg：500μL。带有氨基基团标记的四甲基罗丹明荧光染料分子衍生物的添加量满足带有氨基基团标记的四甲基罗丹明荧光染料分子衍生物与赭曲霉毒素A的配比可为1.3mg：1mg。氨基基团标记的四甲基罗丹明荧光染料分子衍生物，其英文名称Tetramethylrhodaminecadaverine，Invitrogen公司。所述从所述反应产物中分离得到所述赭曲霉毒素A荧光探针可包括利用高效液相色谱从所述反应产物中分离得到所述赭曲霉毒素A荧光探针。所述赭曲霉毒素A荧光探针可为保留时间为6.3分钟、8分钟和/或9.3分钟下的物质，三者具有相同的分子量(900.33-900.34g/mole之间)，为同分异构体。所述成套试剂1中，所述赭曲霉毒素A抗体可为赭曲霉毒素A单克隆抗体。所述赭曲霉毒素A单克隆抗体可为OTA的的小鼠单克隆免疫抗体(Abcam公司)。所述成套试剂1中各物质均可独立包装。所述成套试剂1中所述赭曲霉毒素A荧光探针与所述赭曲霉毒素A抗体的配比可为1:1。本专利技术还提供了另一种用于检测赭曲霉毒素A的成套试剂，记为成套试剂2，所述成套试剂2由所述赭曲霉毒素A荧光探针、所述赭曲霉毒素A抗体与赭曲霉毒素A组成。所述成套试剂2中各物质均可独立包装。所述赭曲霉毒素A荧光探针，也属于本专利技术的保护范围。本专利技术还提供了用于检测赭曲霉毒素A的试剂盒，所述试剂盒含有所述成套试剂1、所述成套试剂2或所述赭曲霉毒素A荧光探针。本专利技术还提供了检测赭曲霉毒素A的方法，所述方法包括：向待测样品中添加所述赭曲霉毒素A荧光探针和所述赭曲霉毒素A抗体，得到待测体系；混合所述赭曲霉毒素A荧光探针和所述赭曲霉毒素A抗体，得到对照体系，所述待测体系与所述对照体系中的所述赭曲霉毒素A荧光探针和所述赭曲霉毒素A抗体均相等；按照包括如下b1)或b2)或b3)的方法确定待测样品中是否含有赭曲霉毒素A：b1)检测所述对照体系与所述待测体系的荧光强度，如所述待测体系与所述对照体系的荧光强度相等，所述待测样品中不含有或候选不含有赭曲霉毒素A；如所述待测体系的荧光强度小于所述对照体系的荧光强度，所述待测样品中含有或候选含有赭曲霉毒素A；b2)检测所述对照体系与所述待测体系的荧光偏振值，如所述待测体系与所述对照体系的荧光偏振值相等，所述待测样品中不含有或候选不含有赭曲霉毒素A；如所述待测体系的荧光偏振值小于所述对照体系的荧光偏振值，所述待测样品中含有或候选含有赭曲霉毒素A；b3)检测所述对照体系与所述待测体系的荧光各向异性值，如所述待测体系与所述对照体系的荧光各向异性值相等，所述待测样品中不含有或候选不含有赭曲霉毒素A；如所述待测体系的荧光各向异性值小于所述对照体系的荧光各向异性值，所述待测样品中含有或候选含有赭曲霉毒素A。上述方法中，所述待测体系与所述对照体系中所述赭曲霉毒素A荧光探针和所述赭曲霉毒素A抗体的摩尔比均可为1:1。上述方法中，荧光强度的检测的激发波长为550纳米，发射波长为575纳米。上述方法中，荧光偏振值的检测的激发波长为550纳米，发射波长为575纳米。上述方法中，荧光各向异性值的检测的激发波长为550纳米，发射波长为575纳米。所述成套试剂1，或所述成套试剂2，或所述赭曲霉毒素A荧光探针，或所述试剂盒在定性或定量检测待测样品中赭曲霉毒素A中的应用，也属于本专利技术的保护范围。所述成套试剂1，或所述成套试剂2，或所述赭曲霉毒素A荧光探针在制备定性或定量检测待测样品中赭曲霉毒素A试剂盒中的应用，也属于本专利技术的保护范围。上述应用中，所述待测样品可为食品。所述食品可为酒，如啤酒或红酒。实验证明，利用本专利技术的赭曲霉毒素A荧光探针以及由其与赭曲霉毒素A抗体组成的成套试剂可以成功检测赭曲霉毒素A，对赭曲霉毒素A检测限为1-2500nM，并可以成功从赭曲霉毒素A，赭曲霉毒素B，伏马毒素B1，伏马毒素B2，玉米赤霉烯酮和黄曲霉毒素B1中检测到赭曲霉毒素A，检测范围宽，灵敏度高，且操作简单，检测时间短，具有广泛的应用前景。附图说明图1为利用TMR标记的OTA荧光探针和免疫抗体基于荧光强度变化检测OTA。A：荧光光谱曲线随着不同浓度OTA的变化情况，曲线由上至下，对应的OTA的浓度分别为0,1,2,3.9,7.8,15.6,31.2,62.5,125,250,500nM；B：发射波长为575纳米处对应的发射荧光的荧光强度与OTA的浓度的关系。图2为利用TMR标记的OTA荧光探针基于荧光强度变化检测OTA的特异性结果。图3为利用TMR标记的OTA荧光探针和免疫抗体基于荧光偏振或荧光各向异性变化检测OTA。A：荧光偏振值变化，B：荧光各向异性值变化。图4为利用TMR标记的OTA荧光本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.用于检测赭曲霉毒素A的成套试剂，由赭曲霉毒素A荧光探针和赭曲霉毒素A抗体组成；/n所述赭曲霉毒素A荧光探针由四甲基罗丹明荧光染料分子标记赭曲霉毒素A得到。/n

【技术特征摘要】
1.用于检测赭曲霉毒素A的成套试剂，由赭曲霉毒素A荧光探针和赭曲霉毒素A抗体组成；
所述赭曲霉毒素A荧光探针由四甲基罗丹明荧光染料分子标记赭曲霉毒素A得到。


2.根据权利要求1所述的成套试剂，其特征在于：所述赭曲霉毒素A荧光探针按照包括如下步骤的方法制备得到：
将赭曲霉毒素A、N-羟基琥珀酰亚胺、N-(3-二甲氨基丙基)-N'-乙基碳二亚胺盐酸盐与N,N-二甲基甲酰胺反应，然后加入带有氨基基团标记的四甲基罗丹明荧光染料分子衍生物进行反应，得到反应产物，从所述反应产物中分离得到所述赭曲霉毒素A荧光探针。


3.根据权利要求1或2所述的成套试剂，其特征在于：所述赭曲霉毒素A抗体为赭曲霉毒素A单克隆抗体。


4.用于检测赭曲霉毒素A的成套试剂，由权利要求1-3中任一所述赭曲霉毒素A荧光探针和所述赭曲霉毒素A抗体与赭曲霉毒素A组成。


5.权利要求1或2中所述的赭曲霉毒素A荧光探针。


6.用于检测赭曲霉毒素A的试剂盒，含有权利要求1-4中任一所述成套试剂或权利要求1或2中所述的赭曲霉毒素A荧光探针。


7.检测赭曲霉毒素A的方法，包括：向待测样品中添加权利要求1-3中任一所述赭曲霉毒素A荧光探针和所述赭曲霉毒素A抗体，得到待测体系；混合权利要求1-3中任一所述赭曲霉毒素A荧光探针和所述赭曲霉毒素A抗体，得到对照体系，所述待测体系与所述对照体系中的所述赭曲霉毒...

【专利技术属性】
技术研发人员：赵强，李亚飘，张宁，汪海林，
申请(专利权)人：中国科学院生态环境研究中心，
类型：发明
国别省市：北京;11