一种基于酶促点击反应信号放大磁弛豫时间免疫传感器检测兽药残留的方法技术

本发明专利技术提供一种基于酶促点击反应信号放大磁弛豫时间免疫传感器检测兽药残留的方法，包括以下步骤：1)用待检兽药完全抗原包被酶标板并进行封闭；2)加入待测样品和待检兽药单克隆抗体，进行竞争免疫反应；3)加入碱性磷酸酶标记的二抗；4)加入磷酸化抗坏血酸酯，反应后生成抗坏血酸；5)向反应液中加入Cu

Detection of veterinary drug residues by magnetic relaxation time immunosensor based on enzyme click response signal amplification

【技术实现步骤摘要】
一种基于酶促点击反应信号放大磁弛豫时间免疫传感器检测兽药残留的方法
本专利技术属于食品安全分析领域，涉及兽药残留的检测方法，尤其是涉及一种基于酶促点击反应信号放大磁弛豫时间免疫传感器检测兽药残留的方法。
技术介绍
兽药残留是造成我国食品安全问题的一个重要原因，过量或者不合理使用兽药会造成大量的兽药残留在环境和动物体内，并通过食物链在人体内富集，造成抗药性、过敏、人体菌群失衡等严重的安全问题，进而引发组织器官病变，人体免疫能力降低，严重者甚至可能造成药物中毒、诱发癌变等，国际组织与各国食品安全管理部门均制订了相应食品中兽药残留的最高限量标准。我国农业部公告的《动物性食品中兽药最高残留限量》(第235号)中，对食品中兽药残留量作了明确规定：莱克多巴胺，沙丁胺醇等“瘦肉精”是非法添加的药物，在动物性食品中不得检出。因此，对“瘦肉精”等非法添加药物的检测，需要检测方法具有很高的灵敏度和准确性。另外，有些抗生素是可以使用的，例如磺胺类抗生素是可以使用的，不超过一定的含量就是安全的，因此要求检测方法的灵敏度适中就可以，但要求方法相对简单，容易操作。目前，对食品中兽药残留进行定性定量检测的方法包括仪器分析法、免疫分析法和生物传感器，仪器分析方法主要通过气相色谱仪、高效液相色谱仪、高效液相色谱-质谱联用仪等大型精密仪器进行检测，具有灵敏度高、准确性好等优势，但是仪器分析的样品前处理比较复杂，仪器昂贵，检测成本较高，同时，还需要高水平的专业技术人员操作，不适合现场快速检测。免疫分析法主要包括酶联免疫吸附测定法(ELISA)和胶体金免疫层析试纸条方法，ELISA具有操作相对简单、高通量等优势，但其灵敏度一般在ng/mL级别，线性范围较窄，且不适用于痕量检测。胶体金免疫层析试纸条具有操作简单、反应速度快、适合现场快速检测等优点，但其灵敏度比ELISA低，线性范围较窄，无法满足痕量兽药残留等小分子物质检测的需要。磁弛豫时间免疫传感器是一种典型的生物传感器，该免疫传感器的基本原理是：将偶联有抗体的超顺纳米磁颗粒作为磁信号探针，通过抗体-抗原的识别作用，超顺纳米磁颗粒的状态会由原来的分散状态变成聚集状态，导致磁场均匀性发生改变，进而引起周围水分子质子的横向弛豫时间(transverserelaxationtime，T2)发生显著改变，然后利用磁弛豫时间共振仪获取T2值。由于磁信号(T2)的改变与超顺磁性纳米颗粒的状态改变相关，因此通过测量T2可以间接得到目标物的含量。磁弛豫时间免疫传感器的主要优势在于：(1)信号的读出不依赖光信号，避免了复杂基质的干扰，减少了样品前处理等复杂步骤；(2)检测体系是一种均相反应体系，减少了传统酶联免疫分析中多次洗板和显色等步骤，大大提高了检测效率；(3)磁弛豫时间共振仪具有便携化和小型化的潜力，在现场快速检测等领域具有很好的应用前景。但是该方法缺乏有效的信号放大系统，因此灵敏度较低，不适合检测“瘦肉精”等小分子物质。有效的信号放大系统是提高传统磁弛豫时间免疫传感器的关键。免疫标记酶具有很高的催化活性，可以起到很好的信号放大作用，在免疫分析中得到了广泛的应用。因此，本专利技术拟构建一种酶促信号放大的磁弛豫时间免疫传感器，并将其应用于兽药残留的检测。但是，怎样将酶促信号放大和磁弛豫时间免疫传感技术有机结合起来，就成为了一个关键问题。一价铜离子可以催化叠氮和炔基之间的点击反应，而二价铜离子可以被还原剂(抗坏血酸)还原变成一价铜离子，进而可以催化叠氮和炔之间的点击反应。如果将叠氮分子和炔基分子分别修饰在纳米磁颗粒的表面，在点击反应发生之后，就可以导致纳米磁颗粒由原来的分散状态变成聚集状态，进而导致磁信号的改变，磁信号的改变和一价铜离子的浓度成正相关。碱性磷酸酶是免疫分析中一种常用的标记酶，其具有去磷酸基团的作用，可以将没有还原性的磷酸化抗坏血酸酯去磷酸化基团，进而变成具有还原性的抗坏血酸。抗坏血酸可以将二价铜离子还原成一价铜离子，进而催化修饰有叠氮分子和炔基分子的纳米磁颗粒之间的点击反应，导致磁颗粒的聚集，横向弛豫时间(T2)随即发生改变。基于磁颗粒状态改变的这个读出方式，我们可以用来检测灵敏度要求不高的抗生素残留，例如磺胺类药物，我们称为这个方法叫做状态聚集的磁弛豫时间传感方法(aggregatedmagneticrelaxationswithching,aMRS)。对于禁用的兽药或者含量极低的兽药残留，我们制备一个大粒径的点击反应配体分子修饰的磁颗粒，例如1000nm的磁颗粒，因为大粒径的磁颗粒的饱和磁强度大，很容易磁分离，而小粒径的磁颗粒，例如30nm的磁颗粒则不能磁分离。因此，通过点击反应和磁分离步骤，也可以实现溶液中小粒径磁颗粒数量的改变。因为前期研究表明磁信号(T2)对磁颗粒数量的改变更为敏感，基于磁颗粒数量改变的读出方式，我们称之为数量变化的磁弛豫时间传感方法(numbermagneticrelaxationswitching,nMRS)。因此，通过碱性磷酸酶可以将点击反应和磁弛豫时间免疫传感器有机结合起来，基于酶促信号放大和点击反应，有效地构建一个信号放大系统，用来提高传统的磁弛豫时间免疫传感器的灵敏度和稳定性，并且用于“瘦肉精”和常用抗生素的检测。相比于传统的磁弛豫时间免疫传感器，该方法灵敏度的提高主要得益于三个方面：(1)酶促信号放大：碱性磷酸酶可以高效地催化产生具有还原性的抗坏血酸，为后面的点击反应奠定基础；(2)点击反应导致磁颗粒状态改变或者数量改变的能力更强：相比抗体等生物识别元件，点击反应配体分子要小很多，因此在相同的磁颗粒表面，点击反应配体分子偶联的密度更大，更加有利于磁颗粒状态的改变或者数量的改变；同时点击反应是一种共价键的反应，很稳定，聚集后的磁颗粒不容易重新发生分散，提高了方法的稳定性，克服了传统的基于抗体-抗原的非共价反应导致的稳定性差，灵敏度不高的难题；(3)基于纳米磁颗粒的分离作用，T2信号来源于小磁颗粒的数量改变，相比于磁颗粒状态变化，T2信号对磁颗粒数量变化更为敏感。
技术实现思路
传统的磁弛豫时间传感器大多基于抗原-抗体相互作用、供体-受体识别作用和适配体-目标物相互作用等非共价相互作用来导致磁颗粒的聚集，从而引起磁信号的变化。这种非共价结合导致的磁颗粒状态改变的程度不大，导致方法的灵敏度不高，无法实现对痕量的小分子的检测。并且这种非共价结合的作用力导致的磁颗粒聚集体很容易在复杂基质中重新分散，进而影响整个方法的稳定性。相比于抗体-抗原这种非共价结合，点击反应诱导的共价结合反应可以很好地克服传统的磁弛豫时间传感器的缺点。本专利技术旨在提供一种由酶促点击化学反应介导的灵敏度高、稳定性更好、可以根据兽药残留需要，选择不同的磁信号读出模式，实现高灵敏和可操作性的统一的磁弛豫时间免疫传感器，并将其用于检测食品中的不同兽药残留的分析，为动物源性食品安全检测提供快速、灵敏、准确的检测方法。具体地，为达到此目的，本专利技术提供以下技术方案：一种基于酶促点击反应信号放大磁弛豫时间免疫传感器对兽药残留进行检测的方法，包括以下步骤：1)用待检兽药完全本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种基于酶促点击反应信号放大磁弛豫时间免疫传感器检测兽药残留的方法，其特征在于包括以下步骤：/n1)用待检兽药完全抗原包被酶标板并进行封闭；/n2)加入待测样品和待检兽药单克隆抗体，进行竞争免疫反应；/n3)加入碱性磷酸酶标记的二抗，反应后洗涤；/n4)继续向酶标板中加入磷酸化抗坏血酸酯，反应后生成抗坏血酸；/n5)向反应液中加入Cu

【技术特征摘要】
1.一种基于酶促点击反应信号放大磁弛豫时间免疫传感器检测兽药残留的方法，其特征在于包括以下步骤：
1)用待检兽药完全抗原包被酶标板并进行封闭；
2)加入待测样品和待检兽药单克隆抗体，进行竞争免疫反应；
3)加入碱性磷酸酶标记的二抗，反应后洗涤；
4)继续向酶标板中加入磷酸化抗坏血酸酯，反应后生成抗坏血酸；
5)向反应液中加入Cu2+，叠氮-MNP偶联物和炔基-MNP偶联物，抗坏血酸将Cu2+还原为Cu+并催化叠氮和炔基发生点击反应，导致磁颗粒从分散变成聚集或者结合磁分离导致磁颗粒数量的改变，根据不同的检测对象，选择这两种灵敏度不同的磁信号读出方式即磁颗粒聚集或者磁颗粒数量的改变，最终通过测定横向弛豫时间并计算待测样品中的目标物含量。
所述叠氮-MNP偶联物的粒径为10-50nm，所述炔基-MNP偶联物的粒径为10-50nm或500-3000nm。


2.如权利要求1所述检测兽药残留的方法，其特征在于：对于含量很低的兽药，所述叠氮-MNP偶联物的粒径为10-50nm，所述炔基-MNP偶联物的粒径为500-3000nm，发生点击反应后进行磁分离，取上清液未反应的叠氮-MNP偶联物,测定其横向弛豫时间并计算待测样品中的目标物含量；对于含量...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈翊平，王知龙，
申请(专利权)人：华中农业大学，
类型：发明
国别省市：湖北;42