用于检测前列腺腺体基底膜完整性的试剂盒及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种用于检测前列腺腺体基底膜完整性的试剂盒及其使用方法和应用，试剂盒包括枸橼酸盐、非免疫动物血清封闭液、兔源性抗TRIB1单克隆抗体、第二抗体和二氨基联苯胺显色剂，其中，第二抗体靶向结合兔源性抗TRIB1单克隆抗体采用本发明专利技术提供的试剂盒，能够准确地检测出人体前列腺组织TRIB1的表达位置及水平，根据TRIB1的表达位置能判断前列腺癌的侵犯情况，根据TRIB1的表达量能有效的判断肿瘤免疫抑制状态，进而预测前列腺癌是否会生化复发以及发展进程。

A kit for detecting the basement membrane integrity of prostate gland and its application

【技术实现步骤摘要】
用于检测前列腺腺体基底膜完整性的试剂盒及其应用
本专利技术涉及前列腺癌病理辅助诊断
，尤其是一种用于检测前列腺腺体基底膜完整性的试剂盒及其应用。
技术介绍
中国前列腺癌的发病率近十年来增速明显，这与人口老龄化密切相关。根据美国癌症协会的报告，前列腺癌目前是欧美老年男性的“头号杀手”。不同国家的前列腺癌的发病率存在较大差异。美国的前列腺癌发病率已经超越肺癌，成为发病率最高的男性恶性肿瘤。但近年来呈明显的上升趋势。人类TRIB1蛋白，也被称为C8FW、GIG2、TRB1和SKIP1，编码基因位于染色体8q24.13。TRIB1在多种组织中都有表达，包括骨骼肌、胰腺、甲状腺、骨髓、外周血单核细胞和脂肪组织。TRIB1能够调控细胞内的NFKB信号通路，从而影响细胞外分泌的细胞因子，如IL8，CXCL1，CXCL2等，这些细胞因子能调节肿瘤微环境中的巨噬细胞，促进单核/巨噬细胞向II型巨噬细胞转化。从而出现肿瘤免疫抑制，诱导肿瘤细胞免疫逃逸。在人的前列腺组织中，TRIB1能稳定的表达在基底细胞的细胞核膜上，对于病理判断前列腺腺体基底细胞膜是否完整提供可靠的依据，同时，TRIB1能稳定的显示基底细胞来源的肿瘤干细胞，良好的显示肿瘤侵袭范围。不仅如此，在临床数据分析发现，TRIB1蛋白高密度表达能有效预测前列腺癌的生化复发。当前对前列腺癌的治疗以抗雄激素及手术切除治疗为主，以及术前前列腺穿刺得到前列腺组织样本，依据格利森(Gleason)评分来进行前列腺癌病理分级。病理诊断前列腺癌中，前列腺癌的基底细胞状态非常重要。在基底细胞向肿瘤干细胞转化过程中，目前临床诊断用的基底细胞分子如P53等都会消失，不利于观察基底细胞来源的肿瘤干细胞生长情况，因此难以准确地预测前列腺癌是否会生化复发以及发展进程。
技术实现思路
基于上述问题，本专利技术的目的在于克服上述现有技术的不足之处而提供一种用于检测前列腺腺体基底膜完整性的试剂盒，以其检测结果为基础，能够准确地预测前列腺癌是否会生化复发以及发展进程。为实现上述目的，本专利技术采取的技术方案包括以下几个方面：在第一个方面，用于检测前列腺腺体基底膜完整性的试剂盒，包括枸橼酸盐、非免疫动物血清封闭液、兔源性抗TRIB1单克隆抗体、第二抗体和二氨基联苯胺显色剂，其中，第二抗体靶向结合兔源性抗TRIB1单克隆抗体。优选地，所述试剂盒中各组分的用量分别为：所述枸橼酸盐为粉剂，所述兔源性抗TRIB1单克隆抗体的稀释倍数为1:100。需要说明的是，上述用量为100人次的检测用量，根据需要还可以调整为10次、30次、50次、80次、120次、200次等或者更多次用量。在第二个方面，本专利技术提供了上述试剂盒的使用方法，包括如下步骤：1)准备超纯水，将枸橼酸盐充分溶解，配置成10mmol/L的枸橼酸盐溶液；2)另外准备超纯水，加入30％(W/W)H2O2；准备1×TBST溶液1L；3)将待测病理切片用二甲苯清洗；4)将切片用100％酒精清洗；5)将切片用95％酒精清洗；6)将切片用超纯水清洗；7)将切片放置枸橼酸盐溶液内微波炉煮沸5～10分钟，始终保持切片在枸橼酸盐溶液内；8)将切片用超纯水清洗；9)将切片浸泡在3％(W/W)的H2O2内；10)将切片用超纯水清洗；11)将切片用TBST清洗；12)每张切片加100ul的非免疫动物血清，室温下孵育；13)移去非免疫动物血清，每张切片加100ul的稀释后的第一抗体，4℃孵育过夜；14)将切片移到室温，复温10分钟；用TBST清洗；15)每张切片加50ul免疫组化加强检测试剂，室温孵育；16)用TBST清洗切片；17)加30ul的DAB浓缩液至1mlDAB稀释液，混匀；18)每张切片加200ul的DAB混合液，染色，染色时间由肉眼或显微镜下观察，染色明显即可终止；19)用超纯水清洗切片；20)将切片在95％的酒精中浸泡；21)将切片在100％的酒精中浸泡；22)用中性树胶将组织用盖玻片封片，待中性树胶干燥后科在纤维镜下观察；23)免疫组织化学检测结果判断结果判定标准：Leica荧光显微镜下，每张切片随机选取五个高倍镜视野观察细胞，基底细胞细胞核膜出现棕黄或棕褐色颗粒为阳性细胞，观察基底细胞是否连续用于判断前列腺腺体是否完整，肿瘤是否侵犯到间质；根据阳性细胞染色强度以及阳性细胞在总细胞中所占数量比例判定实验结果；按染色强度评分：无色为0分，淡黄色为1分，棕黄色为2分，棕褐色为3分；然后按阳性细胞率评分：肿瘤细胞内无阳性染色者为0分，阳性细胞率≤10％为1分，11％～50％为2分，51％～75％为3分，＞75％为4分，两者积分的乘积作为染色结果的评判标准：0定为-，阴性；1～4分为+，弱阳性；5～8分为++，阳性；9～12分为+++，强阳性。在第三个方面，本专利技术提供了上述试剂盒在制备前列腺癌病理辅助诊断剂中的应用。在第四个方面，本专利技术提供了上述的试剂盒在制备预测前列腺癌生化复发的试剂中的应用。综上所述，本专利技术的有益效果为：采用本专利技术提供的试剂盒，能够准确地检测出人体前列腺组织TRIB1的表达位置及水平，根据TRIB1的表达位置能判断前列腺癌的侵犯情况，根据TRIB1的表达量能有效的判断肿瘤免疫抑制状态，进而预测前列腺癌是否会生化复发以及发展进程。附图说明图1为498例患者的随访结果中，TRIB1与生化复发的曲线图；图2为在TCGA数据库中，TRIB1与细胞因子(CXCL1\CXCL2\CXCL3\CXCL6\IL8)的相关性统计结果图；图3为TRIB1在前列腺癌和正常前列腺组织中的染色图；图4为TRIB1与免疫抑制细胞CD136+巨噬细胞表达关系统计图；图5为过表达TRIB1对PC3增殖力的影响的检测结果图；图6为过表达TRIB1对PC3侵袭性影响的检测结果图；图7为过表达TRIB1对PC3细胞凋亡影响的检测结果图；图8为过表达TRIB1对PC3细胞周期影响的检测结果图；图9为过表达TRIB1对PC3迁移能力影响的检测结果图；图10为过表达TRIB1诱导PC3肿瘤组织生长的动物成瘤及肿瘤重量统计图；图11为PR807c芯片染色整体照片。具体实施方式本专利技术提供了一种能检测前列腺基底膜完整性的试剂盒，可用于前列腺癌病理辅助诊断，该试剂盒的检测结果可用于预测前列腺癌生化复发。为更好的说明本专利技术的目的、技术方案和优点，下面将结合附图和具体实施例对本专利技术作进一步说明。如无特别说明，本专利技术中的试剂均可从市场或其它公开渠道获得。如无特别说明，本专利技术中的试剂浓度均为质量浓度。如无特别说明，本专利技术中的实验方法均为常规方法。实施例1本专利技术中用于检测前列腺腺体基本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.用于检测前列腺腺体基底膜完整性的试剂盒，其特征在于，包括枸橼酸盐、非免疫动物血清封闭液、兔源性抗TRIB1单克隆抗体、第二抗体和二氨基联苯胺显色剂，其中，第二抗体靶向结合兔源性抗TRIB1单克隆抗体。/n

【技术特征摘要】
1.用于检测前列腺腺体基底膜完整性的试剂盒，其特征在于，包括枸橼酸盐、非免疫动物血清封闭液、兔源性抗TRIB1单克隆抗体、第二抗体和二氨基联苯胺显色剂，其中，第二抗体靶向结合兔源性抗TRIB1单克隆抗体。


2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中各组分的用量分别为：



所述枸橼酸盐为粉剂，所述兔源性抗TRIB1单克隆抗体的稀释倍数为1:100。


3.权利要求1或2所述的试剂盒的使用方法，其特征在于，包括如下步骤：
1)准备超纯水，将枸橼酸盐充分溶解，配置成10mmol/L的枸橼酸盐溶液；
2)另外准备超纯水，加入30％(W/W)H2O2；准备1×TBST溶液1L；
3)将待测病理切片用二甲苯清洗；
4)将切片用100％酒精清洗；
5)将切片用95％酒精清洗；
6)将切片用超纯水清洗；
7)将切片放置枸橼酸盐溶液内微波炉煮沸5～10分钟，始终保持切片在枸橼酸盐溶液内；
8)将切片用超纯水清洗；
9)将切片浸泡在3％(W/W)的H2O2内；
10)将切片用超纯水清洗；
11)将切片用TBST清洗；
12)每张切片加100ul的非免疫动物血清，室温下孵育；
13)移去非免疫动物血清，每张切片加100ul的稀释后的第一抗体，4℃孵育过夜；
14)将切片移到室温，复温10分钟；用TBST清洗；
15)...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘泽贞，钟惟德，何慧婵，卓扬佳，
申请(专利权)人：广州市第一人民医院广州消化疾病中心，广州医科大学附属市一人民医院，华南理工大学附属第二医院，
类型：发明
国别省市：广东;44