非洲猪瘟病毒抗体检测试剂盒制造技术

本申请提供非洲猪瘟病毒抗体检测试剂盒，涉及动物传染病检测领域，具体涉及非洲猪瘟病毒抗体检测试剂盒。非洲猪瘟病毒抗体检测试剂盒，包括采用重组多肽串联蛋白R10和重组蛋白PS273R包被的酶标板，所述重组多肽串联蛋白R10的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示，所述重组蛋白PS273R的氨基酸序列如SEQ ID NO：4所示。本发明专利技术非洲猪瘟病毒抗体检测试剂盒能够快速、准确、高特异性地对非洲猪瘟病毒抗体进行检测。

African swine fever virus antibody detection kit

【技术实现步骤摘要】
非洲猪瘟病毒抗体检测试剂盒
本专利技术涉及动物传染病检测领域，具体涉及非洲猪瘟病毒抗体检测试剂盒。
技术介绍
非洲猪瘟(ASF)是由非洲猪瘟病毒(ASFV)引起的一种急性、热性、高度接触性传染病。猪科动物和蜱类是ASF的易感动物，其中家猪高度易感，死亡率高达100％，无明显的品种、年龄和性别差异。ASFV基因组包括160～175个开放阅读框，编码150～200种蛋白质。目前，ASF没有有效的疫苗可用于预防，抗体检测为阳性即表明动物已经或曾经感染了病毒。随着ASFV入侵我国后大规模的蔓延，ASF很可能成为我国的又一常在的主要猪病，因此抗体检测在该病的控制和诊断中具有重要意义。现有技术中，还没有可以高效检测非洲猪瘟抗体的试剂盒。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供非洲猪瘟病毒抗体检测试剂盒，该试剂盒能够快速、准确、高特异性地对非洲猪瘟病毒抗体进行检测。本专利技术的目的采用如下技术方案实现：非洲猪瘟病毒抗体检测试剂盒，包括采用重组多肽串联蛋白R10和重组蛋白PS273R包被的酶标板，所述重组多肽串联蛋白R10的氨基酸序列如SEQIDNO:2所示，所述重组蛋白PS273R的氨基酸序列如SEQIDNO：4所示。在本专利技术中，所述重组多肽串联蛋白R10的包被浓度为0.6～20μg/ml，所述重组蛋白PS273R的包被浓度为0.6～20μg/ml。优选的技术方案中，所述重组多肽串联蛋白R10的包被浓度为1～1.5μg/ml，所述重组蛋白PS273R的包被浓度为2～3μg/ml。在本专利技术中，所述重组多肽串联蛋白R10采用如下方法制备：将重组多肽串联蛋白R10基因插入载体pET-28a(+)中，然后转化大肠杆菌，诱导表达后纯化，得到重组多肽串联蛋白R10。在本专利技术中，所述重组蛋白PS273R采用如下方法制备：将重组蛋白PS273R基因插入载体pET-21a(+)中，然后转化大肠杆菌，诱导表达后纯化，得到重组蛋白PS273R。在本专利技术中，所述试剂盒还包括非洲猪瘟阳性对照血清、非洲猪瘟阴性对照血清的制备、样品稀释液、HRP-羊抗猪IgG酶标抗体、TMB底物显色液和终止液。在本专利技术中，所述样品稀释液为0.5-1.5％脱脂乳溶液。本专利技术通过将重组多肽串联蛋白R10和重组蛋白PS273R组合包被酶标板，建立了MP-ELISA抗体检测试剂盒。其制造成本低廉，检测速度快，敏感性和特异性分别高达96.58％和98.61％，非常适用于ASFV的血清学的准确诊断和流行病学调查。附图说明图1是纯化后的重组多肽串联蛋白R10的SDS-PAGE电泳图，其中M：ProteinMarker；1：纯化后的重组多肽串联蛋白R10。图2是纯化后的重组蛋白PS273R的SDS-PAGE电泳图，M：ProteinMarker；1：纯化后的重组蛋白PS273R。图3是重组多肽串联蛋白R10和重组蛋白PS273R的Western-bloting鉴定，M：ProteinMarker；1：pET-21a空载体插入BL21诱导表达后裂解液上清；2：pET-28a空载体插入BL21诱导表达后裂解液上清；3：纯化的重组蛋白PS273R；4：纯化的重组多肽串联蛋白R10。图4显示了各单抗原包被浓度对P/N值的影响。图5显示了样品稀释度对P/N值的影响。图6显示了样品稀释液对P/N值的影响。图7是阴性对照OD450nm值频数分布图。图8是阴性对照OD450nm值正态分布图。图9是阳性对照OD450nm值频数分布图。图10是阳性对照OD450nm值正态分布图。图11.对样品检测的ROC分析，其中(A)是检测AFSV阴、阳性血清所得S/P值的散点分布图，阳性血清n＝117，阴性血清n＝342；(B)是检测AFSV阴、阳性血清所得S/P值的ROC曲线分析图。具体实施方式主要仪器：恒温振荡培养箱，恒温培养箱，PCR扩增仪，高速冷冻离心机，电泳仪，转印仪，酶标仪等。主要试剂与耗材：BamHI、XhoI、HindⅢ(NEB，美国)，质粒提取试剂盒(Omega，美国)，Ni-NTAagarose(碧云天)，Bradford蛋白定量试剂盒，Tryptosephosphatebroth，HRP-羊抗猪IgG酶标抗体(Bethyl，美国)，TMB底物显色液(碧云天)，异丙基硫代-β-D半乳糖苷(IPTG)(TaKaRa)，胰蛋白胨和酵母抽提物(OXOID)等。菌株、质粒：(1)菌株：大肠杆菌BL21(DE3)购自大连TaKaRa公司。(2)质粒：pET-21a(+)质粒购自Novagen公司。抗原与血清：(1)非洲猪瘟灭活抗原，由中国农业科学院哈尔滨兽医研究所非洲猪瘟专业实验室提供。(2)非洲猪瘟抗体阳性参考血清，由中国农业科学院哈尔滨兽医研究所非洲猪瘟专业实验室提供。(3)非洲猪瘟抗体阴性参考血清，由江苏省农业科学院兽医研究所提供。(4)非洲猪瘟抗体阴性特异性血清：猪呼吸与繁殖综合征病毒IgG抗体阳性样品(PRRS)，猪伪狂犬IgG抗体阳性样品(PRV)，猪口蹄疫病毒IgG抗体阳性样品(FMDV)，猪圆环病毒2型IgG抗体阳性样品(PCV-2)，猪瘟病毒IgG抗体阳性样品(CSFV)猪流感病毒IgG抗体阳性样品(SIVH1，H3)，猪肺炎支原体IgG抗体阳性样品(MHP)和副猪嗜血杆菌IgG抗体阳性样品(HPS10型，2型，8型，3型)由江苏省农业科学院兽医研究所保存提供。本专利技术中的PBST，均是指含有0.05％(体积百分浓度)吐温-20的PBS溶液，其中的PBS缓冲液的浓度为0.01mol/L、pH值＝7.2～7.4。实施例1包被抗原蛋白的制备1.P54E基因重组载体的构建参考NCBI数据库公布的我国首例非洲猪瘟P54全基因序列(MH766894，E183L，162222-162776)，设计了重组多肽串联蛋白R10的基因(SEQIDNO:1)，重组多肽串联蛋白R10的氨基酸序列如SEQIDNO:2所示。重组多肽串联蛋白R10的基因是符合大肠杆菌嗜性的。采用基因合成的方式(由南京金斯瑞生物科技有限公司)将重组多肽串联蛋白R10的基因插入载体pET-28a(+)的多克隆酶切位点EcoRⅠ和HindⅢ之间，得到重组质粒pET-28a-R10。通过“热激”法，将重组质粒pET-28a-R10转化E.coliBL21(DE3)感受态细胞，获得重组菌pET-28a-R10(BL21)。2.PS273R基因重组载体的构建参考NCBI数据库公布的我国首例非洲猪瘟PS273R基因序列(MH766894，S273R，146675-147496)，对密码子进行了针对大肠杆菌的嗜性优化，得到了重组蛋白PS273R的基因序列，如SEQIDNO：3所示，对应的氨基酸序列如SEQIDNO：4所示。采用基因合成的方式(南京金斯瑞生物科技有限公司)将SEQIDNO：3所示本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.非洲猪瘟病毒抗体检测试剂盒，其特征在于包括采用重组多肽串联蛋白R10和重组蛋白PS273R包被的酶标板，所述重组多肽串联蛋白R10的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示，所述重组蛋白PS273R的氨基酸序列如SEQ ID NO：4所示。/n

【技术特征摘要】
1.非洲猪瘟病毒抗体检测试剂盒，其特征在于包括采用重组多肽串联蛋白R10和重组蛋白PS273R包被的酶标板，所述重组多肽串联蛋白R10的氨基酸序列如SEQIDNO:2所示，所述重组蛋白PS273R的氨基酸序列如SEQIDNO：4所示。


2.根据权利要求1所述非洲猪瘟病毒抗体检测试剂盒，其特征在于所述重组多肽串联蛋白R10的包被浓度为0.6～20μg/ml，所述重组蛋白PS273R的包被浓度为0.6～20μg/ml。


3.根据权利要求2所述非洲猪瘟病毒抗体检测试剂盒，其特征在于所述重组多肽串联蛋白R10的包被浓度为1～1.5μg/ml，所述重组蛋白PS273R的包被浓度为2～3μg/ml。


4.根据权利要求1或2或3所述非洲猪瘟病毒抗体检测试剂盒，其特征在于所述重组多肽串联蛋白R10和重组蛋白PS273R分别采用如下方法制备：将重组多肽串联蛋白R10基因或重组蛋白PS273R基因插入载体中，然后转化大肠杆菌，诱导表达后纯化，得到重组多肽串联蛋白R10或重组...

【专利技术属性】
技术研发人员：冯志新，白昀，邵国青，熊祺琰，郝飞，华利忠，陈蓉，谢青云，谢星，甘源，杨浩，
申请(专利权)人：江苏省农业科学院，
类型：发明
国别省市：江苏;32