一种高通量超灵敏双标记时间分辨免疫层析试纸条及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种高通量超灵敏双标记时间分辨免疫层析试纸条及其应用。该高通量超灵敏双标记时间分辨免疫层析试纸条包括样本垫、硝酸纤维素薄膜、吸水垫和PVC底板，所述硝酸纤维素薄膜上有两条检测线和一条质控线；所述检测线上分别包被小分子化合物A和小分子化合物B的抗原；所述质控线上包被羊抗鸡抗体。本发明专利技术还公开了成套时间分辨荧光微球偶联抗体探针，其由时间分辨荧光微球标记的抗小分子化合物A的抗体、时间分辨荧光微球标记的抗小分子化合物B的抗体和时间分辨荧光微球标记的鸡IgY抗体组成。利用本发明专利技术试纸条和成套时间分辨荧光微球偶联抗体探针可以实现快速、灵敏、准确的检测多种小分子有害化合物。

A high throughput, super sensitive, double labeled time-resolved immunochromatographic strip and its application

【技术实现步骤摘要】
一种高通量超灵敏双标记时间分辨免疫层析试纸条及其应用
本专利技术属于食品安全领域中的小分子有害化合物检测，具体涉及一种高通量超灵敏双标记时间分辨免疫层析试纸条及其应用。
技术介绍
免疫层析技术是将免疫技术和色谱层析技术优点融为一体的近几年快速兴起的免疫分析技术。该方法已广泛应用于小分子物质检测等方面。以硝酸纤维素膜材料为固相，待测样本为流动相，通过毛细层析作用使得待测物与膜上针对待测物的受体发生特异性反应，层析过程中样品溶液中的待测物与NC膜上的检测线发生反应，通过检测或者肉眼观看标记物的颜色来确定检测结果。免疫层析技术的核心除了抗原抗体的特异性结合外，还有标记物的选择。标记物偶联着抗原或抗体，通过标记物的显色强度来定性定量分析待测物。传统的胶体金标记物灵敏度难以满足人们的要求。因此，还需用寻求更加灵敏的标记物。镧系元素(Ln)是指包括镧、铈、镨、钕等15种从第57号元素镧到第71号元素镥的稀土元素。稀土元素因其荧光寿命长、斯托克位移大、发射峰极窄、生物相溶性好的优点，常用来作为生物标记材料使用。时间分辨荧光微球是将大量的稀土元素嵌入或者包埋在聚合物材料中，形成稳定的微球结构。与传统的荧光纳米标记材料相比，时间分辨荧光微球除了具有荧光稳定性好、荧光信号强、荧光寿命长等优点，还能减少基质干扰、降低本底值，进一步提高检测灵敏度高。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题是如何同时简便、快速、高灵敏的检测两种不同的化合物。为了解决上述技术问题，本专利技术首先提供了一种试剂盒。所述试剂盒包括操作简便的高通量超灵敏双标记时间分辨免疫层析试纸条和成套时间分辨荧光微球偶联抗体探针；所述成套时间分辨荧光微球偶联抗体探针由时间分辨荧光微球标记的抗小分子化合物A的抗体、时间分辨荧光微球标记的抗小分子化合物B的抗体和时间分辨荧光微球标记的鸡IgY抗体组成；所述试纸条由依次连接并固定于基底层上的样品垫、设有检测线T1、检测线T2和质控线的包被膜，以及吸水垫组成；所述检测线T1、所述检测线T2和所述质控线相互分离；所述检测线T1处包被有小分子化合物A抗原；所述抗小分子化合物A的抗体能够特异性结合小分子化合物A抗原；所述检测线T2处包被有小分子化合物B抗原；所述抗小分子化合物B的抗体能够特异结合小分子化合物B抗原；所述质控线处包被有羊抗鸡二抗；所述羊抗鸡二抗能够特异性结合鸡IgY抗体；所述检测线T1位于所述包被膜靠近所述样品垫的一端；所述质控线位于所述包被膜靠近所述吸水垫的一端。上述试剂盒中，所述时间分辨荧光微球是将稀土元素包埋在球形聚苯乙烯材料中形成的聚苯乙烯稀土离子配合物。所述时间分辨荧光微球标记的抗小分子化合物A的抗体、所述时间分辨荧光微球标记的抗小分子化合物B的抗体和所述时间分辨荧光微球标记的鸡IgY抗体均通过活泼酯法将时间分辨荧光微球的氨基与抗体表面的羧基偶联制备得到。具体制备方法如下：(1)取5μL时间分辨荧光微球溶液加入到500μL的0.2mol/L硼酸硼砂缓冲液(pH8.0)中，涡旋混匀后加入分别加入1μgEDC和1μgNHS，在摇床上避光活化15min。(2)完成步骤(1)后，加入8μg黄曲霉毒素B1单克隆抗体或1μg玉米赤霉烯酮单克隆抗体或5μg的鸡IgY抗体，室温反应2h或4℃反应过夜。(3)完成步骤(2)后，加入50μL含有1％Tween20的10％BSA溶液，摇床上室温封闭2h，充分封闭微球表面多余的活化位点。(4)完成步骤(3)后，将封闭后的荧光探针，在4℃，12000rpm离心10min，弃上清，收集沉淀。(5)完成步骤(4)后，向沉淀中加入200μL复溶液复溶，超声混悬，得到浓度为0.04μg/mL的时间分辨荧光微球偶联黄曲霉毒素B1单克隆抗体溶液、浓度为5μg/mL的时间分辨荧光微球偶联玉米赤霉烯酮单克隆抗体溶液、浓度为25μg/mL的时间分辨荧光微球偶联鸡IgY抗体溶液。上述试剂盒中，所述抗小分子化合物A的抗体为抗小分子化合物A的多克隆抗体或单克隆抗体；所述抗小分子化合物B的抗体为抗小分子化合物B的多克隆抗体或单克隆抗体；所述检测线T1处包被有小分子化合物A抗原与羧甲基肟和牛血清白蛋白的偶联物；所述检测线T2处包被有小分子化合物B抗原与羧甲基肟和牛血清白蛋白的偶联物。上述试剂盒中，所述稀土元素为铕；所述抗小分子化合物A的抗体为抗小分子化合物A的单克隆抗体；所述抗小分子化合物B的抗体为抗小分子化合物B的单克隆抗体；所述抗小分子化合物A的单克隆抗体和所述抗小分子化合物B的单克隆抗体均为鼠源单克隆抗体。上述试剂盒中，所述基底层的材料为聚氯乙烯；所述样品垫为玻璃纤维素膜；所述包被膜为硝酸纤维素膜；所述检测线T1与所述检测线T2之间的距离为3mm；所述检测线T2与所述质控线之间的距离为3mm。上述试剂盒中，所述小分子化合物A具体为黄曲霉毒素B1；所述小分子化合物B具体为玉米赤霉烯酮。为了解决上述技术问题，本专利技术又提供了上述试剂盒的制备方法。本专利技术提供的上述试剂盒的制备方法包括如下步骤：分别制备上述试剂盒中的试纸条和成套时间分辨荧光微球偶联抗体探针；制备所述试纸条的方法包括如下步骤：I、分别制备所述样品垫、所述设有检测线T1、检测线T2和质控线的包被膜，以及所述吸水垫；II、将步骤I得到的所述样品垫、步骤I得到的所述设有检测线T1、检测线T2和质控线的包被膜与所述吸水垫依次粘贴到所述基底层上，得到所述试纸条；所述设有检测线T1、检测线T2和质控线的包被膜按照如下方法制备：将所述小分子化合物A抗原、所述小分子化合物B抗原和所述羊抗鸡二抗分别喷涂在所述包被膜的检测线T1区域、检测线T2区域和质控线区域，形成所述检测线T1、检测线T2和所述质控线，得到所述设有检测线T1、检测线T2和质控线的包被膜；制备所述成套时间分辨荧光微球偶联抗体探针的方法为上述时间分辨荧光微球标记的抗小分子化合物A的抗体、时间分辨荧光微球标记的抗小分子化合物B的抗体和时间分辨荧光微球标记的鸡IgY抗体的制备方法。为了解决上述技术问题，本专利技术还提供了上述试剂盒或上述方法的新用途。本专利技术提供了上述试剂盒或上述方法在同时检测两种不同的小分子化合物中的应用。本专利技术还提供了上述试剂盒或上述方法在同时检测待测样本中是否含有两种不同的小分子化合物中的应用。本专利技术还提供了上述试剂盒或上述方法在同时检测待测样本中两种不同的小分子化合物含量中的应用。为了解决上述技术问题，本专利技术还提供了一种同时检测待测样本中是否含有两种不同的小分子化合物的方法。本专利技术提供的同时检测待测样本中是否含有两种不同的小分子化合物的方法包括如下步骤：(a1)向待测样本中加入上述成套时间分辨荧光微球偶联抗体探针，得到混合溶液；(a2)将所述混合溶液孵育5m本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种试剂盒，其包括试纸条和成套时间分辨荧光微球偶联抗体探针；/n所述成套时间分辨荧光微球偶联抗体探针由时间分辨荧光微球标记的抗小分子化合物A的抗体、时间分辨荧光微球标记的抗小分子化合物B的抗体和时间分辨荧光微球标记的鸡IgY抗体组成；/n所述试纸条由依次连接并固定于基底层上的样品垫、设有检测线T1、检测线T2和质控线的包被膜，以及吸水垫组成；/n所述检测线T1、所述检测线T2和所述质控线相互分离；/n所述检测线T1处包被小分子化合物A抗原；所述抗小分子化合物A的抗体能够特异性结合小分子化合物A抗原；/n所述检测线T2处包被小分子化合物B抗原；所述抗小分子化合物B的抗体能够特异结合小分子化合物B抗原；/n所述质控线处包被有羊抗鸡二抗；所述羊抗鸡二抗能够特异性结合鸡IgY抗体；/n所述检测线T1位于所述包被膜靠近所述样品垫的一端；/n所述质控线位于所述包被膜靠近所述吸水垫的一端。/n

【技术特征摘要】
1.一种试剂盒，其包括试纸条和成套时间分辨荧光微球偶联抗体探针；
所述成套时间分辨荧光微球偶联抗体探针由时间分辨荧光微球标记的抗小分子化合物A的抗体、时间分辨荧光微球标记的抗小分子化合物B的抗体和时间分辨荧光微球标记的鸡IgY抗体组成；
所述试纸条由依次连接并固定于基底层上的样品垫、设有检测线T1、检测线T2和质控线的包被膜，以及吸水垫组成；
所述检测线T1、所述检测线T2和所述质控线相互分离；
所述检测线T1处包被小分子化合物A抗原；所述抗小分子化合物A的抗体能够特异性结合小分子化合物A抗原；
所述检测线T2处包被小分子化合物B抗原；所述抗小分子化合物B的抗体能够特异结合小分子化合物B抗原；
所述质控线处包被有羊抗鸡二抗；所述羊抗鸡二抗能够特异性结合鸡IgY抗体；
所述检测线T1位于所述包被膜靠近所述样品垫的一端；
所述质控线位于所述包被膜靠近所述吸水垫的一端。


2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：
所述时间分辨荧光微球是将稀土元素包埋在球形聚苯乙烯材料中形成的聚苯乙烯稀土离子配合物；
或，所述时间分辨荧光微球标记的抗小分子化合物A的抗体、所述时间分辨荧光微球标记的抗小分子化合物B的抗体和所述时间分辨荧光微球标记的鸡IgY抗体均通过活泼酯法将时间分辨荧光微球的氨基与抗体表面的羧基偶联制备得到。


3.根据权利要求1或2所述的试剂盒，其特征在于：
所述抗小分子化合物A的抗体为抗小分子化合物A的多克隆抗体或单克隆抗体；
或，所述抗小分子化合物B的抗体为抗小分子化合物B的多克隆抗体或单克隆抗体。


4.根据权利要求1-3任一所述的试剂盒，其特征在于：
所述稀土元素为铕；
或，所述抗小分子化合物A的抗体为抗小分子化合物A的单克隆抗体；
或，所述抗小分子化合物B的抗体为抗小分子化合物B的单克隆抗体。


5.根据权利要求1-4任一所述的试剂盒，其特征在于：
所述基底层的材料为聚氯乙烯；
或，所述样品垫为玻璃纤维素膜；
或，所述包被膜为硝酸纤维素膜；
或，所述检测线T1与所述检测线T2之间的距离为3mm；
或，所述检测线T2与所述质控线之间的距离为3mm。


6.根据权利要求1-5任一所述的试剂盒，其特征在于：
所述小分子化合物A为黄曲霉毒素B1；所述小分子化合物B为玉米赤霉烯酮。


7.权利要求1-6任一所述的试剂盒的制备方法，包括如下步骤：分别制备权利要求1-6任一所述的试剂盒中的试纸条和权利要求1-6任一所述的试剂盒中的成套时间分辨荧光微球偶联抗体探针；
制备所述试纸条的方法包括如下步骤：
I、分别制备所述样品垫、所述设有检测线T1、检测线T2和质控线的包被膜，以及所述吸水垫；
II、将步骤I得到的所述样品垫、步骤I得到的所述设有检测线T1、检测线T2和质控线的包被膜与所述吸水垫依次粘贴到所述基底层上，得到所述试纸条；
所述设有检测线T1、检测线T2和质控线的包被膜按照如下方法制备：将所述小...

【专利技术属性】
技术研发人员：江海洋，郑丕苗，王战辉，沈建忠，温凯，吴聪明，史为民，曹兴元，丁双阳，李建成，张艳芳，王梓乐，
申请(专利权)人：中国农业大学，
类型：发明
国别省市：北京;11