一种牛支原体双抗夹心ELISA检测试剂盒及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种牛支原体双抗夹心ELISA检测试剂盒，该试剂盒包括包被有牛支原体多克隆抗体的酶标板、辣根过氧化物酶标记的抗牛支原体MbovP579蛋白的单克隆抗体，所述单克隆抗体是由杂交瘤细胞株1A2分泌的，所述杂交瘤细胞株1A2保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：C2018219。本发明专利技术实现了针对牛支原体抗原的特异性检测，且能够检出牛支原体的敏感度为10

A double antibody sandwich ELISA kit for Mycoplasma bovis and its application

【技术实现步骤摘要】
一种牛支原体双抗夹心ELISA检测试剂盒及其应用
本专利技术属于病原微生物检测领域，具体涉及一种用于检测牛支原体的双抗夹心ELISA试剂盒，本专利技术还涉及一种非诊断目的检测牛支原体的双抗体夹心ELISA方法。
技术介绍
牛支原体(Mycoplasmabovis,M.bovis)为一种能够感染任何年龄牛的致病微生物，可导致患牛严重的呼吸系统疾病、生殖系统疾病、角膜炎、乳腺炎及关节炎等。1961年，牛支原体初次在美国从乳腺炎患牛中分离出来，全球范围内均报道了由牛支原体感染导致奶牛乳房炎而造成经济损失的案例。在我国，牛支原体于2008年首次在湖北地区“疑似牛肺疫”的患牛中被发现，感染率为50％-100％，病死率为10％-50％，给我国养牛业造成巨大经济损失。现阶段，尚无有效的商品化牛支原体疫苗流通于市场，准确而快速的诊断是高效防控牛支原体病的基础。牛支原体的检测主要依靠病原的分离鉴定。由于牛支原体属于兼性厌氧生物、对分离用培养基营养要求严格、经常受到临床应用抗生素的影响，而且培养周期较长(继代培养通常需72小时以上)，分离特别耗时；在分离后需要开展进一步的生化鉴定或生物学鉴定，不能作为早期快速诊断牛支原体感染的方法。PCR检测方法灵敏度较高，但需要对病料样本进行复杂的处理，且可能会因为污染导致假阳性。此外也需要一定的实验室条件和仪器设备，无法实现高通量的检测。目前市场上的牛支原体ELISA试剂盒大多只能检测牛支原体抗体，而且检测特异性和灵敏度很低。因此，开发一种快捷、简便、特异性强、敏感性高的检测方法将为牛支原体的鉴别诊断及疫苗研发质量控制提供有效的保障。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种用于检测牛支原体的双抗夹心ELISA试剂盒，本专利技术还提供一种非诊断目的检测牛支原体的双抗体夹心ELISA方法。本专利技术所提供的试剂盒和检测方法对牛支原体的检测具有特异性强、灵敏度高以及操作简便等优点，可以实现大批量样本的快速检测。为实现第一个目的，本专利技术提供了一种牛支原体双抗夹心ELISA检测试剂盒，该试剂盒包括：包被有牛支原体多克隆抗体的酶标板、辣根过氧化物酶标记的抗牛支原体MbovP579蛋白的单克隆抗体。优选地，所述抗牛支原体MbovP579蛋白的单克隆抗体是由杂交瘤细胞株1A2分泌的，所述杂交瘤细胞株1A2保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCCNO：C2018219。优选地，该试剂盒还包括：封闭液、稀释液、洗涤液、显色液、终止液。该试剂盒不仅能应用于牛支原体的临床疾病诊断，同时还能应用于非诊断目的牛支原体实验室鉴别和高通量筛选，为疫苗研发提供可靠有效的质量控制保障。为实现第二个目的，本专利技术还提供一种非诊断目的检测牛支原体的双抗体夹心ELISA方法，该方法包括以下步骤：(1)稀释纯化后的牛支原体多克隆抗体并包被酶标板；(2)洗涤酶标板，加入封闭液，封闭酶标板；(3)洗涤酶标板，加入待检样本，进行反应；(4)将辣根过氧化物酶标记的单克隆抗体稀释后加入酶标板，进行反应；(5)洗涤酶标板，加入TMB底物，室温避光显色10min；(6)加入终止液，混匀后酶标仪测定OD450nm值；(7)结果判定：测量孔/阴性孔≥2.1为阳性，其余孔为阴性；所述单克隆抗体是抗牛支原体MbovP579蛋白的单克隆抗体，它是由杂交瘤细胞株1A2分泌的，所述杂交瘤细胞株1A2保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCCNO：C2018219。优选地，所述牛支原体多克隆抗体的包被浓度为250ng/孔。优选地，所述封闭液为含5％体积FBS(胎牛血清)的PBS缓冲液。优选地，所述辣根过氧化物酶标记的单克隆抗体的稀释倍数是1：800体积比。为了进一步提高样本的最低检测限，所述待检样本在加入前还进行了预增菌处理，处理方法是，将待检样本经0.45μm滤器过滤，以1:10体积比接种于牛支原体PPLO液体培养基，5％CO2、37℃培养36h。根据本专利技术的实施例，最佳的一种检测方法是：(1)稀释纯化后的牛支原体多克隆抗体，250ng/孔包被酶标板，4℃作用过夜；(2)洗涤酶标板，加入封闭液，200μL/孔，置37℃孵育60min；(3)洗涤酶标板，加入待检样本，100μL/孔，置37℃孵育90min；(4)将辣根过氧化物酶标记的单克隆抗体按1：800体积比稀释，加入酶标板，100μL/孔，置37℃孵育90min；(5)洗涤酶标板，加入TMB底物，200μL/孔，室温避光显色10min；(6)加入终止液，50μL/孔，混匀后酶标仪测定OD450nm值；(7)结果判定：测量孔/阴性孔≥2.1为阳性，其余孔为阴性。本专利技术以牛支原体多抗作为捕获抗体，能特异性且广谱的捕获样本中的牛支原体，与采用单抗作为捕获抗体相比，其灵敏度更高、显色背景颜色值更低。本专利技术以抗牛支原体MbovP579蛋白的单克隆抗体为检测抗体，它不仅与牛支原体具有良好的反应原性，同时也具有很高的特异性，能够与牛支原体包括临床分离株和标准参考株反应，而与无乳支原体、精氨酸支原体、绵羊肺炎支原体及鸡毒支原体等无交叉反应性，因此能提高检测结果的准确性。本专利技术通过对检测条件进行优化和筛选，最终建立了牛支原体的双抗夹心ELISA检测方法，实现了针对牛支原体抗原的特异性检测，该方法能够检出牛支原体的敏感度为108CFU/mL。通过对样本进行预增菌处理，可以使1CFU/mL的样本达到检测的敏感度标准。与现有技术相比，本专利技术具有操作简便、人员技术水平要求低、主观因素误差小、设备简单等优点，可以快速实现大批量样品的检测分析。附图说明：图1：牛支原体多克隆抗体的Westernblot验证。M：Marker；1：牛支原体全菌蛋白；2：rMbovP579蛋白。图2：SDS-PAGE分析牛支原体多克隆抗体。M：标准蛋白分子量；1：纯化后的多抗；2：纯化前的多抗。图3：SDS-PAGE分析rMbovP579单抗。M：标准蛋白分子量；1、2：纯化的1A2单抗。具体实施方式实施例1试剂盒的制备1.兔抗牛支原体多克隆抗体的制备1.1牛支原体免疫动物选取日本大耳白兔，免疫前采集耳缘静脉血作为阴性对照。每只兔免疫剂量为0.8mg，并与等体积佐剂乳化30min后皮下注射，共免疫4次。第一次为弗氏完全佐剂，后3次为弗氏不完全佐剂，每次免疫间隔2周。终免后采血用间接ELISA方法测量其效价，当效价达到所需时，行心脏采血收集血清。通过间接ELISA测定牛支原体多克隆抗体效价为100×211。1.2牛支原体多克隆抗体Westernblot分析将牛支原体全菌蛋白和MbovP579重组蛋白进行SDS-PAGE聚丙酰胺凝胶电泳，转膜后封闭，一抗用兔抗牛支原体多克隆抗体血清(1：2000倍稀释)，二抗用HPR-羊抗兔IgG(1：5000稀释)。将收本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种牛支原体双抗夹心ELISA检测试剂盒，其特征在于，该试剂盒包括：包被有牛支原体多克隆抗体的酶标板、辣根过氧化物酶标记的抗牛支原体MbovP579蛋白的单克隆抗体。/n

【技术特征摘要】
1.一种牛支原体双抗夹心ELISA检测试剂盒，其特征在于，该试剂盒包括：包被有牛支原体多克隆抗体的酶标板、辣根过氧化物酶标记的抗牛支原体MbovP579蛋白的单克隆抗体。


2.如权利要求1所述的牛支原体双抗夹心ELISA检测试剂盒，其特征在于：所述抗牛支原体MbovP579蛋白的单克隆抗体是由杂交瘤细胞株1A2分泌的，所述杂交瘤细胞株1A2保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCCNO：C2018219。


3.如权利要求1所述的牛支原体双抗夹心ELISA检测试剂盒，其特征在于，该试剂盒还包括：封闭液、稀释液、洗涤液、显色液、终止液。


4.权利要求1-3任何一项所述的试剂盒在非诊断目的检测牛支原体中的应用。


5.一种非诊断目的检测牛支原体的双抗体夹心ELISA方法，其特征在于包括以下步骤：
(1)稀释纯化后的牛支原体多克隆抗体并包被酶标板；
(2)洗涤酶标板，加入封闭液，封闭酶标板；
(3)洗涤酶标板，加入待检样本，进行反应；
(4)将辣根过氧化物酶标记的单克隆抗体稀释后加入酶标板，进行反应；
(5)洗涤酶标板，加入TMB底物，室温避光显色10...

【专利技术属性】
技术研发人员：胡长敏，郭爱珍，陈颖钰，张文劲，杨莉，陈曦，李雨芮，
申请(专利权)人：华中农业大学，
类型：发明
国别省市：湖北;42