卡那霉素的识别/传感一体化探针及制备方法与检测方法技术

本发明专利技术涉及卡那霉素的识别/传感一体化探针及制备方法与检测方法，属于生物传感技术领域。卡那霉素的识别/传感一体化探针包括金纳米颗粒、适配体链、荧光标记底物链、信号放大反应Trigger链；当待测样品中存在卡那霉素时，适配体链与卡那霉素特异性结合，“激活”被封闭的Trigger链，Trigger链与修饰在纳米金上的底物链杂交，暴露酶切位点；在切刻内切酶的作用下，底物链被切割，标记荧光基团的核酸片段远离纳米金表面，被猝灭的荧光恢复；同时，游离的Trigger链在纳米金表面与其他底物链进行往复的“杂交‑切割”，实现信号放大。最后，通过检测溶液的荧光强度对卡那霉素进行定量。与现有技术相比，本发明专利技术增加了信号放大过程中局部底物浓度，缩短了检测时间。

Identification / sensing integrated probe of kanamycin and its preparation method and detection method

【技术实现步骤摘要】
卡那霉素的识别/传感一体化探针及制备方法与检测方法
本专利技术属于生物传感
，尤其是涉及一种卡那霉素的识别/传感一体化探针及制备方法与检测方法。
技术介绍
卡那霉素作为一种重要的氨基糖苷类抗生素，被广泛用于革兰氏阳性和阴性细菌感染的治疗。但是抗生素的滥用会导致动物源性食品中卡那霉素的残留，通过食品摄入并在体内聚积，引起人体不同程度的损害。因此，实现卡那霉素的快速、灵敏检测尤为重要。目前，基于核酸适配体的抗生素快速检测方法受到广泛关注，这些方法中目标与探针1:1结合比例的局限，使得检测灵敏度受限于适配体和抗生素之间的结合能力，无法满足食品中痕量抗生素残留的检测需求。将核酸适配体识别与核酸恒温扩增技术耦合，通过将抗生素浓度定量地转变为特异性的核酸进行信号放大，能够显著提高抗生素检测灵敏度。但是，在均相核酸恒温扩增反应中，信号的放大过程依赖于底物链浓度，随着反应的进行，底物链浓度逐渐降低，完成信号放大过程往往需要2h或者更长时间，从而导致整个检测过程极为耗时。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题是克服现有基于核酸适配体信号放大策略检测卡那霉素耗时的缺点，而提供一种卡那霉素的识别/传感一体化探针及制备方法与检测方法。本专利技术的目的可以通过以下技术方案来实现：本专利技术首先提供一种卡那霉素的识别/传感一体化探针，所述卡那霉素的识别/传感一体化探针包括金纳米颗粒、适配体链、荧光标记底物链、信号放大反应Trigger链；所述适配体链、荧光标记底物链和信号放大反应Trigger链修饰在金纳米颗粒表面，得到卡那霉素的识别/传感一体化探针，所述卡那霉素的识别/传感一体化探针保存在保存溶液中。进一步地，所述适配体链、荧光标记底物链和信号放大反应Trigger链序列分别为：适配体链：5’-TGGGGGTTGAGGCTAAGCCGA-3’；荧光标记底物链：5’-TTTTTTTTTTGGATCATATAGTAGT-3’；信号放大反应Trigger链：5’-TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTCGGCTTAGCTACTATATGATCCGAACCCCCA-3’；所述荧光标记底物链的5’端修饰-SH，所述荧光标记底物链的3’端修饰荧光基团；所述信号放大反应Trigger链的5’端修饰-SH。在本专利技术的一个实施方式中，所述荧光基团选自以下物质中的一种或几种：Cy系列荧光染料、FAM荧光染料、Rox荧光染料、Alexa系列染料、d6过渡金属配合物或荧光纳米粒子。Cy系列荧光染料即为2,3,3-三甲基-3H-吲哚类碳菁染料，包括Cy3(三甲川菁染料)和Cy5(五甲川菁染料)；FAM荧光染料即为5-羧基荧光素；Rox荧光染料即为6-羧基-X-罗丹明；Alexa系列染料包括AlexaFluor350、AlexaFluor488和AlexaFluor647；d6过渡金属配合物包括铱配合物和铼配合物；荧光纳米粒子包括CdSe/ZnS量子点、碳量子点。本专利技术选用但是并不限于上述的荧光染料，通用的用于标记DNA或RNA的荧光染料均可适用。在本专利技术的一个实施方式中，所述金纳米颗粒、适配体链、信号放大反应Trigger链、荧光标记底物链之间加入的比例关系为：适配体链与信号放大反应Trigger链的摩尔比为1～4：1，荧光标记底物链和信号放大反应Trigger链的摩尔比为5～40：1，三(2-羧乙基)膦和乙酸盐与核酸链的摩尔比为10-100；核酸链与金纳米颗粒的摩尔比300～1000：1，所述核酸链指适配体链、信号放大反应Trigger链及荧光标记底物链。在本专利技术的一个实施方式中，所述保存溶液中，金纳米颗粒的浓度为0.1-5nM，优选为1nM。本专利技术还提供所述卡那霉素的识别/传感一体化探针的制备方法，包括以下步骤：(1)制备纳米金溶液；(2)将适配体链、荧光标记底物链和信号放大反应Trigger链修饰到金纳米颗粒表面，得到卡那霉素的识别/传感一体化探针。在本专利技术的一个实施方式中，步骤(1)中，所述纳米金溶液的浓度为0.1-5nM，优选为1nM。在本专利技术的一个实施方式中，步骤(1)制备纳米金溶液可以采用本领域常规技术手段获得。在本专利技术的一个实施方式中，步骤(2)具体包括以下步骤：S1、将适配体链和信号放大反应Trigger链按照按摩尔比为1～4：1静置杂交；S2、S1所得物加入荧光标记底物链，混合均匀，再加入三(2-羧乙基)膦(TCEP)和乙酸盐缓冲液，静置活化，接着与纳米金溶液混合，震荡孵育；S3、S2所得物加入Tris-Hcl缓冲液，静置孵育，然后，加入NaCl，静置孵育；S4、用PBS缓冲液离心洗涤，去除未标记上的DNA链，保存在保存溶液中，备用。在本专利技术的一个实施方式中，步骤S1中，静置杂交的优选温度为37℃，静置杂交的优选时间为1小时。在本专利技术的一个实施方式中，步骤S2中，适配体链与信号放大反应Trigger链的摩尔比为1～4：1，荧光标记底物链和信号放大反应Trigger链的摩尔比为5～40：1，三(2-羧乙基)膦和乙酸盐与核酸链的摩尔比为10-100；核酸链与金纳米颗粒的摩尔比300～1000：1，所述核酸链指适配体链、信号放大反应Trigger链及荧光标记底物链。在本专利技术的一个实施方式中，步骤S2中，所述荧光标记底物链的5’端修饰-SH，3’端修饰荧光基团。在本专利技术的一个实施方式中，步骤S2中，三(2-羧乙基)膦的浓度为1-20mM，优选为10mM，乙酸盐缓冲液的浓度为100-1000mM，优选为500mM，乙酸盐缓冲液的pH为4-6，优选为5.2。在本专利技术的一个实施方式中，步骤S2中，静置活化的优选温度为20-30℃，优选为25℃，静置活化的优选时间为1小时。在本专利技术的一个实施方式中，步骤S2中，震荡孵育的优选温度为20-30℃，优选为25℃，震荡孵育的优选时间为16小时。在本专利技术的一个实施方式中，步骤S3中，Tris-Hcl缓冲液加入后，Tris-Hcl缓冲液终浓度为5mmol/L。在本专利技术的一个实施方式中，步骤S3中，Tris-Hcl缓冲液优选500mM、pH＝8.2的Tris-Hcl缓冲液。在本专利技术的一个实施方式中，步骤S3中，加入Tris-Hcl缓冲液后静置孵育的优选温度为20-30℃，优选为25℃，加入Tris-Hcl缓冲液后静置孵育的优选时间为30-90min，优选为1小时。在本专利技术的一个实施方式中，步骤S3中，加入NaCl的方式优选为：分4次加入NaCl，每次加入体积比为1:1:2:2。在本专利技术的一个实施方式中，步骤S3中，加入NaCl的浓度优选为1-3M。在本专利技术的一个实施方式中，步骤S3中，加入NaCl本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种卡那霉素的识别/传感一体化探针，其特征在于，所述卡那霉素的识别/传感一体化探针包括金纳米颗粒、适配体链、荧光标记底物链、信号放大反应Trigger链；/n所述适配体链、荧光标记底物链和信号放大反应Trigger链修饰在金纳米颗粒表面，得到卡那霉素的识别/传感一体化探针，所述卡那霉素的识别/传感一体化探针保存在保存溶液中。/n

【技术特征摘要】
1.一种卡那霉素的识别/传感一体化探针，其特征在于，所述卡那霉素的识别/传感一体化探针包括金纳米颗粒、适配体链、荧光标记底物链、信号放大反应Trigger链；
所述适配体链、荧光标记底物链和信号放大反应Trigger链修饰在金纳米颗粒表面，得到卡那霉素的识别/传感一体化探针，所述卡那霉素的识别/传感一体化探针保存在保存溶液中。


2.根据权利要求1所述卡那霉素的识别/传感一体化探针，其特征在于，所述适配体链、荧光标记底物链和信号放大反应Trigger链序列分别为：
适配体链：5’-TGGGGGTTGAGGCTAAGCCGA-3’；
荧光标记底物链：5’-TTTTTTTTTTGGATCATATAGTAGT-3’；
信号放大反应Trigger链：
5’-TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTCGGCTTAGCTACTATATGATCCGAACCCCCA-3’；
所述荧光标记底物链的5’端修饰-SH，所述荧光标记底物链的3’端修饰荧光基团；
所述信号放大反应Trigger链的5’端修饰-SH。


3.根据权利要求2所述卡那霉素的识别/传感一体化探针，其特征在于，所述荧光基团选自以下物质中的一种或几种：Cy系列荧光染料、FAM荧光染料、Rox荧光染料、Alexa系列染料、d6过渡金属配合物或荧光纳米粒子。


4.根据权利要求1所述卡那霉素的识别/传感一体化探针，其特征在于，所述金纳米颗粒、适配体链、信号放大反应Trigger链、荧光标记底物链之间加入的比例关系为：
适配体链与信号放大反应Trigger链的摩尔比为1～4：1，
荧光标记底物链和信号放大反应Trigger链的摩尔比为5～40：1，
核酸链与金纳米颗粒的摩尔比300～1000：1，所述核酸链指适配体链、信号放大反应Trigger链及荧光标记底物链。


5.根据权利要求1所述卡那霉素的识别/传感一体化探针，其特征在于，所述保存溶液中，金纳米颗粒的浓度为0.1-5nM，优选为1nM。


6.权利要求1-5中任一项所述卡那霉素的...

【专利技术属性】
技术研发人员：叶泰，徐斐，张志伟，袁敏，曹慧，于劲松，
申请(专利权)人：上海理工大学，
类型：发明
国别省市：上海;31