一种灵敏探针、检测四环素的方法及应用技术

本发明专利技术公开了一种灵敏探针、检测四环素的方法及应用，包括信号载体和四环素单克隆抗体，信号载体为二硫化钼纳米片，所述的二硫化钼纳米片的粒径为450～550nm、200～300nm和40～60nm。本发明专利技术在免疫检测中将二维二硫化钼纳米片作为信号载体以构建探针，控制非常有限量的抗体是提高灵敏度的关键，二硫化钼比表面积大，表面易于修饰官能团，吸附能力强，生物相容性良好，用较少量的抗体标记二硫化钼作为检测探针，实现高灵敏目标物检测，裸眼检测限可低至0.023ng/mL，与传统金标试纸条的灵敏度相比，至少提高100倍，能成功应用于牛奶、蜂蜜和牛肉样品中的四环素检测。

A sensitive probe, method of tetracycline detection and its application

【技术实现步骤摘要】
一种灵敏探针、检测四环素的方法及应用
本专利技术属于生物检测领域，涉及一种灵敏探针、四环素的检测方法及应用，具体涉及一种用二硫化钼纳米片作为信号载体并标记单克隆抗体的灵敏探针，与试纸条共同快速检测四环素类抗生素及应用。
技术介绍
四环素等抗生素的过量使用在肉制品和海鲜产品中已造成了严重的药物残留，成为危害人类身体健康的食品安全隐患，目前，国内外对四环素进行定性、定量检测比较经典的方法有液相色谱-质谱/质谱法(LC-MS/MS)、气相色谱-质谱联用法(GC-MS)、高效液相色谱法(HPLC)，这些方法虽然准确性高，但仪器价格昂贵，且前处理过程复杂，分析速度慢，专业性要求较高，不适用于大批量样品或现场快速检测。此外，还有常用的酶联免疫法(ELISA)，化学发光法。酶联免疫法可以一次性处理多个样品，灵敏度高但需要操作者具有较高的专业知识，不利于普及使用。化学发光法容易实现自动化，但对环境要求较高不利于现场使用。与之相比，免疫层析法稳定性好、操作简单、无需其它仪器设备且检测速度快、结果直观可靠，适用于现场快速检测。然而，传统的基于胶体金的试纸条，其低灵敏度仍然阻碍了它们的广泛应用，特别是在痕量分析中。
技术实现思路
针对现有技术中的缺陷和不足，本专利技术为解决免疫层析检测低灵敏度的技术问题，提供一种灵敏探针、四环素的检测方法及应用。为了达到上述目的，本专利技术采取的技术方案包括：一种灵敏探针，包括信号载体和四环素单克隆抗体，信号载体为二硫化钼纳米片，所述的二硫化钼纳米片的粒径为450～550nm、200～300nm和40～60nm。具体地，所述的灵敏探针的制备方法包括以二硫化钼纳米片为信号载体，加入四环素单克隆抗体即得。进一步地，制备该灵敏探针的方法包括：(1)制备二硫化钼纳米片：将含有二硫化钼和胆酸钠的混合水溶液超声处理，采用差速区带离心法进行分级处理即得；(2)制备灵敏探针：将四环素单克隆抗体加入步骤(1)中的二硫化钼纳米片溶液中混合反应，离心制得。进一步地，所述的步骤(1)中，二硫化钼和胆酸钠的浓度比为1:(0.2～0.4)。进一步地，所述的步骤(2)中，二硫化钼纳米片与四环素单克隆抗体的浓度比为1:0.001～0.003，二硫化钼纳米片与四环素单克隆抗体混合震荡30～60分钟，再加入100μL的10％牛血清蛋白反应30分钟，封闭2～2.5小时。一种检测四环素的方法，包括将试纸条浸入含有本专利技术所述的灵敏探针中进行检测。进一步地，所述的试纸条包括衬板，衬板上贴有硝酸纤维素膜，硝酸纤维素膜的一端覆盖吸水垫，另一端依次覆盖样品垫和结合垫，硝酸纤维素膜的非覆盖面上沿横向设置检测线和质控线；所述检测线上喷涂有四环素-牛血清白蛋白偶联物，所述质控线上喷涂有羊抗鼠免疫球蛋白。进一步地，检测线上喷涂有四环素-牛血清白蛋白偶联物的制备方法包括：1mg/mL四环素-牛血清白蛋白偶联物溶液以1μL/cm的划线速率喷涂在检测线上得检测线；质控线上喷涂有羊抗鼠免疫球蛋白的制备方法包括：1mg/mL羊抗鼠单克隆抗体包被溶液以1μL/cm的速度喷涂于硝酸纤维素膜上形成质控线，检测线和质控线之间的距离为5mm。本专利技术所述的灵敏探针用于检测牛奶、蜂蜜或牛肉中的四环素。本专利技术所述的检测四环素的方法用于检测牛奶、蜂蜜或牛肉中的四环素。与现有技术相比，其优点与积极效果在于：(1)首次在免疫检测中将二维二硫化钼纳米片作为信号载体以构建探针，控制非常有限量的抗体是提高灵敏度的关键，这项工作为牛奶、蜂蜜和牛肉的实际样品检测四环素类抗生素开发了便宜，灵敏，便携和快速读出的分析系统；(2)本专利技术中制备的二硫化钼比表面积大，表面易于修饰官能团，吸附能力强，生物相容性良好，用较少量的抗体标记二硫化钼作为检测探针，实现高灵敏目标物检测，裸眼检测限可低至0.023ng/mL，与传统金标试纸条的灵敏度相比，至少提高100倍，还具有良好的特异性，整个过程在11分钟内完成，并且能成功应用于牛奶、蜂蜜和牛肉样品检测，说明食品基质对于该试纸条几乎没有影响。这种新颖的基于二维材料的纳米探针在检测抗生素残留方面显示出了巨大的应用潜力。附图说明图1为本专利技术制备的二硫化钼纳米片信号载体的透射电镜表征图；图2为本专利技术制备分级二硫化钼纳米片信号载体的示意图；图3为本专利技术的快速检测四环素的免疫层析试纸条组装示意图；图4为实施例3中1)的结果图；图5为实施例3中2)的结果图；图6为实施例4的结果图；下面结合附图对本专利技术的具体实施方式作进一步的详细说明。具体实施方式本专利技术为了解决免疫层析检测低灵敏度的这个问题，构建了一个新型的二维信号载体，在保证信号物强度的同时，降低了抗体用量，从而提高分析系统的灵敏度，这对于监控动物源性食品中的四环素类抗生素具有很重要的意义和应用价值。为了获得最佳的测定性能，专利技术人挑选了最适合作为信号载体的纳米材料，研究了信号载体偶联抗体的最佳制备方法，并确定了最优的分析条件。最终制得的试纸条用于检测四环素(TET)，特别是对牛奶、蜂蜜和牛肉中的四环素的检测应用，具有可靠、灵敏、稳定、便携、快速和操作简单的特点。作为新型信号载体，二硫化钼纳米片不仅具有适当的尺寸，良好的均匀性，分散性和稳定性，而且具备独特的生物相容性，吸附能力强，所以赋予了它超高的生物分子负载能力。与碳纳米管、二氧化锰纳米花和金属有机骨架等材料相比，合成不受严苛的条件限制，而且化学性质稳定，与抗体的结合方法简单。本专利技术利用超声辅助液相剥离法合成二硫化钼纳米片，差速区带离心法(DZC)可以将不同大小的纳米片加以区分，较大的颗粒会比较小的颗粒更快地沉降，这样就可以把剥离的MoS2纳米片按照大小区分，得到更均一的产物。制备该灵敏探针的方法包括：(1)制备二硫化钼纳米片：将含有二硫化钼和胆酸钠的混合水溶液超声处理，采用差速区带离心法进行分级处理即得；二硫化钼和胆酸钠的浓度比为1:(0.2～0.4)；(2)制备灵敏探针：将四环素单克隆抗体加入步骤(1)中的二硫化钼纳米片溶液中混合，反应离心制得。二硫化钼纳米片与四环素单克隆抗体的浓度比为1:(0.001～0.003)，二硫化钼纳米片与四环素单克隆抗体混合震荡30～60分钟，再加入100μL的10％牛血清蛋白反应30分钟，封闭2～2.5小时。本专利技术的工作原理为：非蛋白质小分子化合物的免疫测定是基于竞争原理，即样品中的分析物与固定在检测线上的抗原竞争结合信号标记的抗体。测试区域的颜色强度取决于信号材料的积累。在检测过程中，随着样品中四环素浓度增加，更多探针的结合位点被四环素占据，导致与检测线上抗原结合的探针数量减少，从而检测线逐渐褪色，直到完全消失。无论样品中四环素浓度如何，过量的探针都会与控制线上的羊抗鼠免疫球蛋白结合，使得控制线总是显色。我们构建的探针，满足了强信号标记极其有限的抗体，因此在相同的信号材料显色效果下，本专利技术的探本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种灵敏探针，其特征在于，包括信号载体和四环素单克隆抗体，信号载体为二硫化钼纳米片，所述的二硫化钼纳米片的粒径为450～550nm、200～300nm和40～60nm。/n

【技术特征摘要】
1.一种灵敏探针，其特征在于，包括信号载体和四环素单克隆抗体，信号载体为二硫化钼纳米片，所述的二硫化钼纳米片的粒径为450～550nm、200～300nm和40～60nm。


2.如权利要求1所述的灵敏探针，其特征在于，所述的灵敏探针的制备方法包括以二硫化钼纳米片为信号载体，加入四环素单克隆抗体即得。


3.如权利要求1或2所述的灵敏探针，其特征在于，制备该灵敏探针的方法包括：
(1)制备二硫化钼纳米片：将含有二硫化钼和胆酸钠的混合水溶液超声处理，采用差速区带离心法进行分级处理即得；
(2)制备灵敏探针：将四环素单克隆抗体加入步骤(1)中的二硫化钼纳米片溶液中混合反应，离心制得。


4.如权利要求3所述的灵敏探针，其特征在于，所述的步骤(1)中，二硫化钼和胆酸钠的浓度比为1:(0.2～0.4)。


5.如权利要求3所述的灵敏探针，其特征在于，所述的步骤(2)中，二硫化钼纳米片与四环素单克隆抗体的浓度比为1:0.001～0.003，二硫化钼纳米片与四环素单克隆抗体混合震荡30～60分钟，再加入100μL的10％牛血清蛋白反应30分钟，封闭2～2.5小时。<...

【专利技术属性】
技术研发人员：王丽，贾珮，补彤，李睿，孙新玉，刘英男，
申请(专利权)人：西北农林科技大学，
类型：发明
国别省市：陕西;61