一种PCV2病毒样颗粒夹心定量ELISA检测法及其应用制造技术

本发明专利技术涉及一种PCV2病毒样颗粒夹心定量ELISA检测法及其应用。利用猪圆环病毒2型PCV2d VLPs免疫小鼠，筛选杂交瘤细胞，制备的抗体可以特异性识别PCV2(PCV2b、PCV2d均可识别)，可用于WB、IFA等PCV2相关检测；利用该抗体包被ELISA检测时发现不与Cap蛋白发生反应，能够用于区分VLPs和Cap。基于该单克隆抗体经过一系列反应条件的优化建立了夹心ELISA，可用于PCV2 VLPs的特异性定量以及定性，检测最低浓度可达到62.5ng/ml，灵敏度高，相关系数R

Detection of PCV2 virus like particles by sandwich quantitative ELISA and its application

【技术实现步骤摘要】
一种PCV2病毒样颗粒夹心定量ELISA检测法及其应用
本专利技术涉及一种PCVd病毒样颗粒夹心定量ELISA检测法及其应用，属于动物疾病诊断和生物制品领域。
技术介绍
猪圆环病毒2型(Porcinecircovirustype2，PCV2)是猪皮炎肾病综合征、断奶仔猪多系统衰竭综合征和繁殖障碍综合征的主要病原体，对养猪行业具有重要的经济效益影响。PCV2基因组约1.7Kb，属于单股正链环状DNA病毒，包含两个主要的开放阅读框，ORF2编码病毒核衣壳蛋白(Cap)，ORF1编码与病毒复制有关的Rep蛋白。病毒核衣壳(Capsid)是由60个Cap蛋白亚基组成的正二十面体，无囊膜，其粒子直径约17nm，目前采用疫苗作为预防方式进行防控，当前市场疫苗主要包括勃林格殷翰、武汉中博以及扬州优邦等利用杆状病毒系统生产的PCV2病毒样颗粒(virus-likeparticles,VLPs)亚单位疫苗，南农高科技股份有限公司生产的PCV2SH株灭活疫苗，普莱柯利用大肠杆菌表达系统生产的PCV2VLPs亚单位疫苗。其中PCV2VLPs亚单位疫苗是由PCV2Cap蛋白组装而形成，不含病毒核酸，不具有感染性，而且能够产生很好的保护效果。目前PCV2VLPs的鉴定方式包括透射电子显微镜、分子筛色谱法、细胞间接免疫荧光法等。透射电子显微镜仪器价格昂贵，操作程序过多，需要专业的技术人员才能够进行熟练操作拍到清晰的图像资料，只能观察VLPs的轮廓。但是不能用于VLPs的准确定量。PCV2VLPs是由60个Cap亚基组装形成的正二十面体，其分子量大，在分子筛中对应的紫外吸收峰很早就出现，因此可以通过读取仪器提供的紫外吸收峰图来判定样本中是否含有PCV2VLPs。在PCV2VLPs的鉴定中也可以利用间接免疫荧光对PCV2VLPs进行鉴定。当PCV2Cap未形成VLPs的时候，无法进入细胞内部，在PCV2Cap组装形成VLPs后，VLPs即可进入细胞内部，随后进行间接免疫荧光等相关操作，如果发现细胞呈现阳性信号，即可判断样本中含有PCV2VLPs，该方法能够鉴定判定VLPs的存在，但不适合定量分析。在PCV2VLPs定量方面，目前还缺乏有效的手段区分VLPs和Cap的含量，检测灵敏度偏低，一般情况下，利用夹心ELISA定量得到的结果是VLPs和Cap两者混合后总体的浓度，也无法同时对PCV2不同基因型的VLPs进行定量，缺乏一种能够分辨VLPs和Cap又能在PCV2不同基因型中对VLPs进行定量的夹心ELISA方法。在现有专利(猪圆环病毒2型双抗体夹心ELISA试剂盒及其应用，申请号201811095919.8)的描述中，利用PCV2Cap蛋白制备单克隆抗体，该单抗在WesternBlot中不识别Cap单个亚基的线性表位，建立双抗夹心ELISA，能对PCV2半成品灭活疫苗进行定量，最低检测值为3μg/ml，但由于VLPs亚单位疫苗是由Cap蛋白在体外组装形成，其中包含的Cap蛋白对定量的影响无法排除，不适用于PCV2VLPs亚单位疫苗的定量。在另外一个现有专利(识别PCV2病毒样颗粒的单克隆抗体及其在定性及定量检测PCV2病毒样颗粒中的应用，申请号201811261025.1)的描述中，通过制备PCV2VLPs制备单克隆抗体，该单抗在WesternBlot中不识别Cap单个亚基的线性表位，利用间接ELISA证明所含的单克隆抗体仅与组装正确的VLP发生特异性抗原抗体反应，但未采用夹心ELISA确认是否能够区分VLPs和Cap蛋白，利用该单抗建立的双抗夹心ELISA最低检测下限为146.48ng/ml。
技术实现思路
本专利技术的目的在于：将PCV2d作为免疫原采用多次免疫方式制备单克隆抗体，该单抗在WesternBlot中能识别Cap单个亚基的线性表位，在建立的双抗夹心ELISA体系中，能够区分VLPs和Cap，且对于PCV2b与PCV2d不同基因型的均能适用，最低检测下限为62.5ng/ml，为后续PCV2b和PCV2dVLPs疫苗的准确定量及质量控制提供基础。本专利技术的技术方案1.一种PCV2病毒样颗粒夹心定量ELISA检测法，其特征在于该检测法包括以下步骤：(1)用pH9.6的碳酸盐将能够有效识别PCV2b和PCV2d的Cap蛋白氨基酸序列，反应呈强阳性的单抗1A6按1:8000稀释，按每孔100μl加入96孔板中包被12h，弃去板中液体，用300μlPBST洗涤5次，拍干剩余液体；(2)分别加入100μlBSA封闭3h，弃去板中液体，用300μlPBST洗涤5次，拍干剩余液体；(3)PCV2dVLPs按100ng/孔加入后，于37℃反应60min，弃去板中液体，用300μlPBST洗涤5次，拍干剩余液体；(4)将兔多抗按1:2000进行稀释后，分别加入孔中于37℃反应60min，弃去板中液体，用300μlPBST洗涤5次，拍干剩余液体；(5)羊抗兔的酶标二抗按1:7000稀释后于37℃反应30min，弃去板中液体，用300μlPBST洗涤5次，拍干剩余液体；(6)加入50μlTMB室温显色5min；(7)加入50μl2M的H2SO4终止反应，OD450读数。2.本专利技术所述一种PCV2d毒样颗粒夹心定量ELISA检测法，其特征在于所述的单抗1A6来源的阳性单克隆细胞系被命名为小鼠杂交瘤单克隆细胞1A6株：该细胞株已于2019年11月01日送交北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所菌种保藏中心保藏，保藏号为CGMCCNo.18844。3.本专利技术所述一种PCV2病毒样颗粒夹心定量ELISA检测法，其特征在于所述的PCV2dVLPs是利用上述两个专利的Cap表达和VLPs构建体系，分别表达PCV2Cap，通过镍柱亲和层析技术将PCV2Cap进行纯化，通过SDS-PAGE进行电泳鉴定后，体外组装成相应的VLPs。4.本专利技术所述一种PCV2病毒样颗粒夹心定量ELISA检测法，其特征在于其中的兔多抗是将纯化后得到的PCV2dVLPs与弗氏佐剂按1:1混合，免疫家兔获得的血清，并对血清中的IgG进行纯化而成。5.本专利技术所述一种PCV2病毒样颗粒夹心定量ELISA检测法，其特征在于其中的羊抗兔的酶标二抗是商品化的产品。6.本专利技术所述一种PCV2病毒样颗粒夹心定量ELISA检测法，其特征在于该检测法可用于PCV2VLPs的特异性定量以及定性，检测最低浓度可达到62.5ng/ml，灵敏度高，相关系数R2为0.992，定量准确性好，7.本专利技术所述一种PCV2病毒样颗粒夹心定量ELISA检测法，其特征在于该检测法可适用于PCV2b与PCV2dVLPs的定量，可应用于PCV2不同基因型VLPs的定量、组装效率鉴定以及PCV2病毒侵染鉴定。8.本专利技术所述一种PCV2病毒样颗粒夹心定量ELISA检测法，其特征在于该检测法可应用于PCV2不同基因型VLPs的定量、组装效率鉴定以及PCV2病毒侵染鉴定。本专利技术的有益效果本发本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种PCV2病毒样颗粒夹心定量ELISA检测法，其特征在于该检测法包括以下步骤：/n(1)用pH 9.6的碳酸盐将能够有效识别PCV2b和PCV2d的Cap蛋白氨基酸序列，反应呈强阳性的单抗1A6按1:8000稀释，按每孔100μl加入96孔板中包被12h，弃去板中液体，用300μlPBST洗涤5次，拍干剩余液体；/n(2)分别加入100μlBSA封闭3h，弃去板中液体，用300μlPBST洗涤5次，拍干剩余液体；/n(3)PCV2d VLPs按100ng/孔加入后，于37℃反应60min，弃去板中液体，用300μl PBST洗涤5次，拍干剩余液体；/n(4)将兔多抗按1:2000进行稀释后，分别加入孔中于37℃反应60min，弃去板中液体，用300μlPBST洗涤5次，拍干剩余液体；/n(5)羊抗兔的酶标二抗按1:7000稀释后于37℃反应30min，弃去板中液体，用300μlPBST洗涤5次，拍干剩余液体；/n(6)加入50μl TMB室温显色5min；/n(7)加入50μl 2M的H

【技术特征摘要】
1.一种PCV2病毒样颗粒夹心定量ELISA检测法，其特征在于该检测法包括以下步骤：
(1)用pH9.6的碳酸盐将能够有效识别PCV2b和PCV2d的Cap蛋白氨基酸序列，反应呈强阳性的单抗1A6按1:8000稀释，按每孔100μl加入96孔板中包被12h，弃去板中液体，用300μlPBST洗涤5次，拍干剩余液体；
(2)分别加入100μlBSA封闭3h，弃去板中液体，用300μlPBST洗涤5次，拍干剩余液体；
(3)PCV2dVLPs按100ng/孔加入后，于37℃反应60min，弃去板中液体，用300μlPBST洗涤5次，拍干剩余液体；
(4)将兔多抗按1:2000进行稀释后，分别加入孔中于37℃反应60min，弃去板中液体，用300μlPBST洗涤5次，拍干剩余液体；
(5)羊抗兔的酶标二抗按1:7000稀释后于37℃反应30min，弃去板中液体，用300μlPBST洗涤5次，拍干剩余液体；
(6)加入50μlTMB室温显色5min；
(7)加入50μl2M的H2SO4终止反应，OD450读数。


2.如权利要求1所述一种PCV2d毒样颗粒夹心定量ELISA检测法，其特征在于所述的单抗1A6来源的阳性单克隆细胞系被命名为小鼠杂交瘤单克隆细胞1A6株：该细胞株已于2019年11月01日送交北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所菌种保藏中心保藏，保藏号为CGM...

【专利技术属性】
技术研发人员：王乃东，邹亚文，杨毅，王东亮，湛洋，杨文兵，董彦鹏，于浩洋，
申请(专利权)人：江苏南农高科技股份有限公司，美国普赛PROCELL生物高科技有限责任公司，湖南农业大学，
类型：发明
国别省市：江苏;32