斯氏艾美耳球虫MIC1蛋白的应用制造技术

本发明专利技术涉及生物技术领域，公开了斯氏艾美耳球虫MIC1蛋白作为兔球虫病诊断抗原等一系列相关应用，相关实验结果显示，斯氏艾美耳球虫MIC1蛋白能被斯氏艾美耳球虫阳性血清识别，具有良好的免疫原性和反应原性；同时在间接ELISA方法中表现出极高敏感性和特异性，种种结果证明斯氏艾美耳球虫MIC1蛋白可以作为兔球虫病的诊断抗原，以及应用到相关疫苗和检测试剂盒中。

Application of mic1 protein of Eimeria skrjabini

【技术实现步骤摘要】
斯氏艾美耳球虫MIC1蛋白的应用
本专利技术涉及生物
，特别涉及斯氏艾美耳球虫MIC1蛋白的应用。
技术介绍
兔球虫病(Rabbitcoccidiosis)是由艾美耳属的多种球虫寄生于家兔的肠道和肝脏所引起的一种原虫性疾病，是家兔的一种常见、多发性疾病，是严重危害家兔的主要疾病之一。斯氏艾美耳球虫(Eimeriastiedai)作为致病力最强的一种兔球虫，主要侵害家兔的肝脏和胆管上皮细胞，导致肝硬化以及胆汁淤积，从而引起严重的肝型兔球虫病。患病家兔主要以腹泻、生长发育迟缓、虚弱消瘦为主要临床特征，严重感染时可导致死亡。由于肝型兔球虫病具有很高的发病率以及死亡率，因此斯氏艾美耳球虫被视为是国内养兔业所面临的危害最大的病原之一，严重制约了我国养兔业的发展。兔球虫病在全世界范围内均存在分布，对于许多国家的养兔业带来了严重的经济损失，其中以肝型兔球虫病致病力最强且流行最为严重。目前该病的确诊需要对患病兔进行剖检，尚缺乏有效的生前诊断方法；已有研究使用斯氏艾美耳球虫卵囊作为天然的诊断抗原进行诊断，然而卵囊作为诊断抗原存在抗原标准品难以收集和制备，来源和用量难以确定，推广和应用困难等一系列的问题。鉴于斯氏艾美耳球虫的强致病性以及其对于养兔业危害的严重性，利用可靠的诊断技术对患病兔进行诊断是有效防控的基础。然而目前有关该病生前诊断的方法尚缺乏报道，因此建立一种血清学诊断方法对肝型兔球虫病进行准确的诊断对该病的防治具有重要意义。
技术实现思路
有鉴于此，本专利技术的目的在于提供斯氏艾美耳球虫MIC1蛋白(EsMIC1)作为兔球虫病的诊断抗原以及在制备兔球虫病的诊断抗原中的应用，使得EsMIC1具有较高的特异性和敏感性，以及良好的免疫原性和反应原性；本专利技术的另外一个目的在于提供EsMIC1在制备检测兔球虫病的试剂盒中的应用，使得以所述EsMIC1建立的ELISA方法显示出其较高的特异性和敏感性，可用于ELISA检测；本专利技术的另外一个目的在于提供EsMIC1在制备兔球虫病疫苗中的应用。在本文中，斯氏艾美耳球虫MIC1蛋白(EsMIC1)可以是非天然的，例如是合成的或者由人工载体表达的(业内常称为重组蛋白rEsMIC1)。术语“非天然的”是指目标物质不是自然界天然存在的，这并不排除所述非天然物质与天然存在的物质具有相同的结构和/或组成。MIC1为糖蛋白G相关蛋白，其包含5个重复的亲水性氨基酸组成的TSP区域，保守跨膜区域(CTD)以及一长末端串疏水氨基酸区域(CTR)；目前未见有关于以斯氏艾美耳球虫为代表的兔球虫MIC的相关研究。本专利技术利用实时荧光定量PCR技术分析了斯氏艾美耳球虫MIC1蛋白(EsMIC1)在虫体不同发育时期的相对转录水平，并对EsMIC1进行了克隆以及原核表达，利用免疫印迹验证了重组蛋白rEsMIC1的反应原性并建立了间接ELISA方法以评估其作为重组抗原对于肝型兔球虫病的诊断价值。结果显示，EsMIC1在斯氏艾美耳球虫裂殖生殖阶段表达量最高，由EsMIC1(全长711bp，序列如SEQIDNO:1所示)基因的ORF编码的蛋白质分子量约为25.89kDa(序列如SEQIDNO:2所示)。免疫印迹显示重组蛋白rEsMIC1能够被斯氏艾美耳球虫阳性血清识别，表明了其具有良好的反应原性。基于rEsMIC1建立的间接ELISA方法具有100％(48/48)的敏感性和97.9％(47/48)的特异性；此外，rEsMIC1可以检测出斯氏艾美耳球虫感染后第6、8、10天的兔血清抗体，且在感染后第10天达到最高的检出率，为62.5％(30/48)。因此，EsMIC1可作为由斯氏艾美耳球虫引起的兔球虫病的候选诊断抗原。基于上述内容，本专利技术提供了斯氏艾美耳球虫MIC1蛋白作为兔球虫病的诊断抗原的应用，以及在制备兔球虫病诊断抗原中的应用。同时，本专利技术还提供了斯氏艾美耳球虫MIC1蛋白在制备诊断兔球虫病的试剂盒中的应用；其中，所述试剂盒优选为ELISA试剂盒，更具体地，该ELISA试剂盒为基于ELISA间接法的试剂盒。此外，本专利技术还提供了斯氏艾美耳球虫MIC1蛋白在制备兔球虫病疫苗中的应用。依据斯氏艾美耳球虫MIC1蛋白在制备试剂盒中的应用，本专利技术提供了一种诊断兔球虫病的ELISA试剂盒，包括包被有斯氏艾美耳球虫MIC1蛋白(EsMIC1)的固相载体。在本专利技术具体实施方式中，所述固相载体可选择为96孔培养板或与其相似的固相载体，所述EsMIC1包被浓度为1.15μg/孔，可采用包被液包被于载体上，包被液由0.39gNa2CO3，35mMNaHCO3，0.2MNaCl，调PH至9.6获得。在确定了试剂盒核心组分后，所述ELISA试剂盒还包括酶标二抗、洗涤液、显色液、封闭液、稀释液、终止液中的一种或两种以上。其中，所述酶标二抗优选为HRP标记的山羊抗兔IgG，在本专利技术具体实施方式中，所述酶标二抗采用购自于武汉博士德生物工程有限公司的产品，酶标二抗稀释比例为1：3000；所述洗涤液优选为PBS-T洗涤液，在本专利技术具体实施方式中，所述PBS-T洗涤液组成为0.01MPBS+0.05％Tween-20；所述显色液优选为TMB显色液；所述封闭液优选为脱脂牛奶，在本专利技术具体实施方式中，所述脱脂牛奶浓度为5％，以0.01MPBS溶液稀释。所述终止液优选为硫酸溶液，浓度优选为2mol/L；配制方法为178mL去离子水中缓慢滴加21.7mL的98％的浓硫酸，冷却至室温，4℃保存；所述稀释液优选为0.01MPBS；配制方法为8gNaCl，0.2gKCl，1.42gNa2HPO4，0.27gKH2PO4，溶于800mL去离子水中，定溶至1L，灭菌后，室温保存。由以上技术方案可知，本专利技术提供了斯氏艾美耳球虫MIC1蛋白作为兔球虫病诊断抗原等一系列相关应用，相关实验结果显示，斯氏艾美耳球虫MIC1蛋白能被斯氏艾美耳球虫阳性血清识别，具有良好的免疫原性和反应原性；同时在间接ELISA方法中表现出极高敏感性和特异性，种种结果证明斯氏艾美耳球虫MIC1蛋白可以作为兔球虫病的诊断抗原，以及应用到相关疫苗和检测试剂盒中。附图说明图1所示为rEsMIC1的表达纯化结果；其中，泳道M：蛋白质标准品Maker；泳道1：经IPTG诱导由大肠杆菌BL21(DE3)表达的rEsMIC1(未纯化)；泳道2：用含有His标签的蛋白纯化柱纯化后的rEsMIC1；图2所示为EsMIC1在斯氏艾美耳球虫不同发育阶段的相对表达量；其中，数据以平均值加标准差的形式展示，其中未孢子化卵囊阶段EsMIC1的表达水平与其余发育阶段均存在显著差异(*表示P<0.05)；图3所示为rEsMIC1的免疫印迹分析；其中，泳道M：蛋白质标准品Maker；泳道1：斯氏艾美耳球虫阳性血清识别的rEsMIC1；泳道2：斯氏艾美耳球虫阴性血清识别的rEsMIC1；泳道3-5：兔疥螨阳性血清识别的rEsMIC1；泳道6-8：兔肠球虫阳性血清识别的rEsMIC1；图4本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.斯氏艾美耳球虫MIC1蛋白作为兔球虫病的诊断抗原的应用和/或在制备兔球虫病诊断抗原中的应用。/n

【技术特征摘要】
1.斯氏艾美耳球虫MIC1蛋白作为兔球虫病的诊断抗原的应用和/或在制备兔球虫病诊断抗原中的应用。


2.斯氏艾美耳球虫MIC1蛋白在制备诊断兔球虫病的试剂盒中的应用。


3.根据权利要求2所述应用，其特征在于，所述试剂盒为ELISA试剂盒。


4.根据权利要求3所述应用，其特征在于，所述ELISA试剂盒为基于ELI...

【专利技术属性】
技术研发人员：杨光友，魏闻芮，彭雪蓉，
申请(专利权)人：四川农业大学，
类型：发明
国别省市：四川;51