一种检测牛副流感病毒3型的免疫荧光试剂及其检测试剂盒制造技术

本发明专利技术属于生物技术领域，具体涉及一种检测牛副流感病毒3型的免疫荧光试剂及其检测试剂盒，所述的免疫荧光试剂是用荧光染料标记的抗牛副流感病毒3型的单克隆抗体；所述的单克隆抗体，是利用牛副流感病毒3型浓缩纯化的病毒粒子作为抗原，采用杂交瘤细胞单克隆抗体技术制备获得。所述的荧光染料为异硫氰酸荧光素(FITC)。所述的单克隆抗体的亚型为IgG2。检测牛副流感病毒3型的免疫荧光试剂盒中的免疫试剂为检测牛副流感病毒3型的免疫荧光试剂。本发明专利技术具有敏感性高特异性强、稳定性好、诊断速度快等优点。

An immunofluorescence reagent and its kit for detection of bovine parainfluenza virus type 3

【技术实现步骤摘要】
一种检测牛副流感病毒3型的免疫荧光试剂及其检测试剂盒
本专利技术属于生物
，具体涉及一种检测牛副流感病毒3型的免疫荧光试剂及其检测试剂盒，适用于牛副流感病毒3型的诊断及组织、血清或细胞中副流感病毒3型的检测与鉴定。
技术介绍
牛副流感病毒3型(Bovineparainfluenzavirustype3,BPIV3)属于单分子负链RNA病毒目副黏病毒科呼吸道病毒属中的成员。牛副流感病毒3型感染牛多表现出精神沉郁、食欲不振、流涕、流泪、咳嗽、发热和呼吸困难等临床症状，同时引起机体的免疫抑制，继而继发感染其他细菌、病毒和支原体，导致牛呼吸道疾病综合征，给养牛业造成极大的危害。1959年美国研究人员从牛体中首次分离到牛副流感病毒3型，目前广泛流行于世界各国。国内的刘鹏等人在2008年从牛的鼻拭子中首次分离出牛副流感病毒3型。对于牛副流感病毒3型的检测，多为血清学检测方法，包括病毒中和试验、间接血凝试验、酶联免疫吸附试验等，这些方法存在着灵敏度不高，检验耗时较长的缺点；PCR作为一种分子生物学检测方法均有检测灵敏、简单的特点，但存在特异性不强、假阳性率较高不足。为此，开展牛副流感病毒3型检测方法的研究，提供一种灵敏、特异性强的牛副流感病毒3型抗原检测手段，对今后疫病的防控和消灭都具有重大意义。
技术实现思路
为解决现有技术中存在的问题，本专利技术提供了一种检测牛副流感病毒3型的免疫荧光试剂及其检测试剂盒，具体的技术方案如下所述：一种检测牛副流感病毒3型的免疫荧光试剂，所述的免疫荧光试剂是用荧光染料标记的抗牛副流感病毒3型的单克隆抗体；所述的单克隆抗体，是利用牛副流感病毒3型浓缩纯化的病毒粒子作为抗原，采用杂交瘤细胞单克隆抗体技术制备获得。所述的荧光染料为异硫氰酸荧光素(FITC)。所述的单克隆抗体的亚型为IgG2。单克隆抗体结合蛋白鉴定杂交瘤细胞分泌的单克隆抗体可与牛副流感病毒3型的重组蛋白N蛋白发生特异性反应，N蛋白氨基酸序列为AGGAVIPGQKNTVSIFALGPSITDDNDKMTLALLFLSHSLDNEKQHAQRAGFLVSLLSMAYANPELYLTSNGSNADVKYVIYMIEKDPGRQKYGGLVVKTREMVYEKTTDWMFGSDLEYDQDNMLQNGRSTSTIEDLVHTFGYPSCLGALIIQVWIILVKAITSISGLRKGFFTRLEAFRQDGTVKSSLVLSGDAVEQIGSIMRSQQSLVTLMVETLITMNTGRNDLTTIEKNIQIVGNYIRDAGLASFFNTIRYGIETRMAALTLSTLRPDINRLKALIELYLSKGPRAPFICILRDPVHGEFAPGNYPALWSYAMGVAVVQNKAMQQYVTGRSYLDIEMFQLGQAVARDAESQMSSILEDELGVTQEAKQSLKKHMKNISSSDTTFHKPTGGSAIEMAIDEEAEQPESRGDQDQGNEPQSSIV。一种检测牛副流感病毒3型的免疫荧光试剂盒，所用的免疫试剂为所述的检测牛副流感病毒3型的免疫荧光试剂。本专利技术的有益效果为：(1)敏感性高：制备的单克隆抗体均有很高的效价，从而确保制备的免疫荧光抗体均有很好的敏感性。(2)特异性强：制备的免疫荧光试剂与其他牛源病原体无交叉反应，只能检测出牛副流感病毒3型，具有很高的特异性。(3)稳定性好：免疫荧光试剂可在2-8℃保存12个月，具有很好的稳定性。(4)诊断速度快：60分钟左右即可报告结果，相比其他方法可节约1-2小时。附图说明图1为本专利技术实施例的本试剂检测牛副流感病毒3型阳性结果的显微镜图。图2为本专利技术实施例的本试剂检测牛副流感病毒3型阴性结果的显微镜图。具体实施方式：为了加深对本专利技术的理解，下面结合附图对本专利技术的实施例做详细的说明。实施例1牛副流感病毒3型抗原的制备将病毒液用0.45μm滤膜过滤去除细胞碎片；向病毒液中缓慢加入固体PEG和NaCl并搅拌，使其终浓度分别为70g/L和23g/L；2-8℃条件下，搅拌过夜；2-8℃条件下，以8000r/min离心50分钟，弃上清，用原体积1％的NTE缓冲液将沉淀物重悬；用NTE缓冲液配制浓度分别为10％、20％、30％、40％和50％的蔗糖溶液，制备10％-50％蔗糖密度梯度，2-8℃条件下，平衡过夜；加入PEG浓缩病毒样品，2-8℃条件下，超高速离心12小时；吸取位于40％蔗糖离心区带的病毒样品，溶解在适量PBS中；经Sepharose4FastFlow(4FF)柱层析系统纯化后用0.22μm滤膜过滤除菌，于-20℃冻存。采用紫外分光光度计测定纯化后的病毒蛋白含量。实施例2抗牛副流感病毒3型单克隆抗体的制备1动物免疫：取浓缩纯化后的病毒蛋白，用适量PBS稀释后与等体积弗氏完全佐剂乳化，腹腔接种BALB/c小鼠，50ug/只；首免后第14天和第28天分别与等体积弗氏不完全佐剂乳化后进行二免与三免；三免后第14天断尾采血分离血清，通过间接ELISA方法检测血清的抗体效价，当血清抗体效价大于1∶10000时，进行细胞融合；细胞融合前3天用不加佐剂的病毒液经尾静脉强化免疫1次，100ug/只。2细胞融合：将SP2/0细胞与免疫小鼠的脾细胞按1∶5的比例混合，以800r/min离心5分钟，弃上清，震荡细胞，使细胞松散混匀；然后于60秒内缓慢加预热的PEG-4000溶液；再缓慢加入无血清的1640培养基终止融合，静置2-3分钟后以700r/min离心5分钟，弃上清；用HAT培养基轻轻重悬，加入到已铺有饲养细胞的96孔细胞板中，100μl/孔；置37℃、含5％CO2培养箱中培养。3杂交瘤细胞株的筛选：采用间接ELISA方法和间接免疫荧光(IFA)方法检测其上清，其中间接ELISA方法检测时采用纯化的病毒蛋白作为检测抗原，间接免疫荧光方法检测时采用病毒培养物为检测抗原。对ELISA与间接免疫荧光均检测为阳性的杂交瘤细胞进行克隆，直至所有细胞克隆孔均为阳性。经过多次克隆后，共获得8株杂交瘤细胞，选取命名为5D8株的杂交瘤细胞进行后期试验。4单克隆抗体特性鉴定4.1单克隆抗体亚类鉴定按免疫球蛋白标准亚类鉴定试剂盒说明书进行，确定单克隆抗体的亚类为IgG2a。4.2杂交瘤细胞株染色体分析采用秋水仙素法对杂交瘤细胞株进行染色体分析，结果显示5D8株杂交瘤细胞的染色体数目为103条。4.3单克隆抗体结合蛋白鉴定杂交瘤细胞分泌的单克隆抗体可与牛副流感病毒3型的重组蛋白N蛋白发生特异性反应。N蛋白氨基酸序列为AGGAVIPGQKNTVSIFALGPSITDDNDKMTLALLFLSHSLDNEKQHAQRAGFLVSLLSMAYANPELYLTSNGSNADVKYVIYMIEKDPGRQKYGGLVVKTREMVYEKTTDWMFGSDLEYDQDNMLQNGRSTSTIEDLVHTFGYPSCL本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种检测牛副流感病毒3型的免疫荧光试剂，其特征在于，所述的免疫荧光试剂是用荧光染料标记的抗牛副流感病毒3型的单克隆抗体；所述的单克隆抗体，是利用牛副流感病毒3型浓缩纯化的病毒粒子作为抗原，采用杂交瘤细胞单克隆抗体技术制备获得。/n

【技术特征摘要】
1.一种检测牛副流感病毒3型的免疫荧光试剂，其特征在于，所述的免疫荧光试剂是用荧光染料标记的抗牛副流感病毒3型的单克隆抗体；所述的单克隆抗体，是利用牛副流感病毒3型浓缩纯化的病毒粒子作为抗原，采用杂交瘤细胞单克隆抗体技术制备获得。


2.根据权利要求1所述的检测牛副流感病毒3型的免疫荧光试剂，其特征在于，所述的荧光染料为异硫氰酸荧光素(FITC)。


3.根据权利要求1所述的检测牛副流感病毒3型的免疫荧光试剂，其特征在于，所述的单克隆抗体的亚型为IgG2。


4.根据权利要求1所述的检测牛副流感病毒3型的免疫荧光试剂，其特征在于，单克隆抗体结合蛋白鉴定杂交瘤细胞分泌的单克隆抗体可与牛副流感病毒3型的重组蛋白N蛋白发生特异性反应，N蛋白氨基酸序列为AGGAVIPGQKNTVSIFALGPSITDDNDKMTLALLFLSHSLDNEKQHAQRAGFLVSLLSMAYANPELYLTS...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈超阳，李真光，和彦良，夏铭崎，孟庆森，朱勇俊，武文慧，闫喜军，武华，
申请(专利权)人：华威特江苏生物制药有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏;32