本发明专利技术提供了一种犬瘟热、貉病毒性肠炎二联冻干灭活疫苗及其制备方法和应用。本发明专利技术提供了一种由全悬浮培养的CDV抗原与微载体悬浮培养的RDPV抗原，经灭活后，与冻干保护剂按一定比例混合冻干制成的二联灭活疫苗。用于貉犬瘟热和貉病毒性肠炎两种疾病的预防。本发明专利技术犬瘟热、貉病毒性肠炎二联冻干灭活疫苗对貉安全、有效，真正做到同时预防貉犬瘟热、貉病毒性肠炎两大疾病。肠炎两大疾病。肠炎两大疾病。
【技术实现步骤摘要】
犬瘟热、貉病毒性肠炎二联冻干灭活疫苗及其制备方法和应用
[0001]本专利技术涉及一种犬瘟热、貉病毒性肠炎二联冻干灭活疫苗及其制备方法和应用，属于兽用生物制品领域。
技术背景
[0002]貉是一种珍贵的毛皮兽，是一种特种农业养殖动物。近年来，随着人们收入的增长和生活水平的提高，国内毛皮市场逐渐旺盛，同时毛皮出口一直保持稳定，带动了毛皮动物养殖的快速发展。貉作为重要的毛皮动物饲养品种，在毛皮动物养殖格局中占有一定比重。在貉养殖密度大的地区，貉养殖业在促进农民增产增收、吸纳农村剩余劳动力以及完善畜牧产业链等方面发挥了重要作用。貉作为传统饲养的毛皮动物种类之一，具有养殖成本低、下崽成活率高、收益稳定等特点，为养殖户创造了良好的经济收益，貉疾病虽少但是也成为困扰养貉业的一大难题，目前，病毒性疾病以貉犬瘟热、貉病毒性肠炎和伪狂犬为主，占比高达90％。
[0003]犬瘟热是由犬瘟热病毒(CDV)引起的犬科高度接触性传染病，在全世界大部分国家和地区均有犬、狐、貉、水貂和多种野生动物暴发犬瘟热的报道。严重危害毛皮动物饲养业，被称为毛皮动物三大疫病之一，具有较高的发病率和死亡率。貉犬瘟热无明显的季节性，一年四季均可发生，传染源主要是发病的貉以及带毒的动物。其眼、鼻的分泌物、体液、粪便等含有大量病毒，可对饲料、水源和用具等造成污染。在自然条件下，所有年龄的肉食毛皮动物均易感，尤其以断乳后的仔貉最易感染，一旦感染犬瘟热，不易治愈，及可能造成规模性传染或死亡，则会给养殖户造成巨大的经济损失。
[0004]貉病毒性肠炎是由貉细小病毒(RDPV)引起的一种急性、高度接触性传染病，发病率和死亡率较高，是危害貉业养殖与发展的重要传染病之一。不同年龄和品种的貉均有易感性，尤以8～12周龄的幼貉最为易感，发病貉出现剧烈腹泻，临床上幼貉的发病率一般在70％以上；7月龄以上成年貉多呈隐性感染，临床腹泻症状不明显，发病率为20％左右。发病貉和感染貉是该病的主要传染源，病毒通过粪便、尿液、口鼻分泌物等排出体外，经消化道和呼吸道传染在貉群内传播。貉病毒性肠炎全年都可发生，常呈地方性流行。一旦传入貉场，防疫卫生措施不完善、消毒不彻底都会导致疾病长期存在或周期性发生，存在养殖隐患。
[0005]所以，貉犬瘟热及貉病毒性肠炎的有效控制，重点在于预防。而目前，国内市场已上市的犬瘟热疫苗或病毒性肠炎相关疫苗多为针对水貂或狐狸的疫苗，尚无针对貉的专用疫苗。并且现有技术多为通过转瓶进行病毒抗原培养，制备过程耗时耗力，所生产抗原批间差异大，疫苗质量较难把控；灭活疫苗在保存过程中，还会出现蛋白(抗原)易降解现象，对疫苗长期保存有很大影响。
[0006]因此更新技术研制出貉专用的安全、有效、利于长期保存的犬瘟热、貉病毒性肠炎疫苗，实现“一针两防”，势在必行，也将进一步推动行业的发展。
技术实现思路
[0007]为解决上述问题，本专利技术提供了一种犬瘟热、貉病毒性肠炎二联冻干灭活疫苗及其制备方法和应用，本专利技术的二联冻干灭活疫苗可用于貉犬瘟热和貉病毒性肠炎两种疾病的预防。
[0008]本专利技术的技术方案：
[0009]一种犬瘟热、貉病毒性肠炎二联冻干灭活疫苗，成分包括犬瘟热病毒抗原及貉细小病毒抗原。
[0010]所述犬瘟热、貉病毒性肠炎二联冻干灭活疫苗，疫苗使用的动物包括貉。
[0011]进一步的，疫苗中犬瘟热病毒含量不低于10
5.5
TCID
50
/头份，貉细小病毒含量不低于10
6.0
TCID
50
/头份。
[0012]进一步的，所述犬瘟热病毒抗原为CDV JTM株，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为：CGMCC No.9905。貉细小病毒抗原为RDPV LT株，为本专利技术单位自主分离获得毒株。
[0013]进一步的，抗原灭活方法为：BEA(2
‑
溴乙胺氢溴酸盐，购自Sigma公司)与NaOH按比例混合，环化成BEI(二乙烯亚胺，环化反应所得产物)，与抗原混合，调节终浓度为0.0005～0.01mol/L，优选为0.002mol/L；30～45℃，优选为37℃，灭活24～48小时；加入硫代硫酸钠溶液使其终浓度为0.005～0.04mol/L，优选为0.02mol/L，进行灭活阻断，完成抗原灭活。
[0014]所述犬瘟热、貉病毒性肠炎二联冻干灭活疫苗的的制备方法，包括以下步骤：
[0015](1)犬瘟热病毒灭活抗原制备：
[0016]选择MDCK细胞，加入无血清营养液培养，使用无血清营养液将细胞密度稀释至4.0
×
106～6.0
×
106个/ml，按病毒感染指数(MOI)0.01～0.1接种生产用毒种培养48～72小时，收获病毒液，抗原液中加入BEI溶液，灭活24～48小时，加入硫代硫酸钠溶液中和，即得犬瘟热病毒灭活抗原；
[0017](2)貉细小病毒灭活抗原制备；
[0018]选择CRFK转瓶细胞，用胰酶消化成单个细胞并计数，加入含6％～10％牛血清的MEM或DMEM培养液，培养1～4小时，按MOI为0.05～0.1同步接种RDPV生产毒种，培养，RDPV病毒含量应不低于10
7.5
TCID
50
/ml，抗原液中BEI溶液，灭活24～48小时，加入硫代硫酸钠溶液，中和1小时，即得貉细小病毒灭活抗原；
[0019](3)配苗及冻干：
[0020]将步骤(1)和步骤(2)获得的灭活抗原按比例混合，配苗时每头份犬瘟热抗原病毒含量不低于10
5.5
TCID
50
，貉细小病毒含量不低于10
6.0
TCID
50
，计算两种抗原配苗用量，用稀释液补充，再与冻干保护剂混合均匀，即为疫苗原液；
[0021](4)疫苗稀释液：
[0022]将佐剂GEL02PR(Montanide Gel 02PR佐剂，购自SEPPIC公司)121℃高压灭菌20～30分钟，与灭菌PBS(0.01mol/L磷酸盐缓冲溶液，主要由磷酸氢二钠、磷酸二氢钾及水配制而成)混匀，无菌定量分装，作为犬瘟热、貉病毒性肠炎二联冻干灭活疫苗的配套稀释液。
[0023]进一步的，所述犬瘟热、貉病毒性肠炎二联冻干灭活疫苗的的制备方法，
[0024]步骤(1)中，接种生产用毒种在37℃、60～100r/min、pH值7.0～7.2、溶氧50％的条件下培养48～72小时，收获病毒液，置
‑
15℃以下保存。CDV病毒含量应不低于10
7.0
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50
/
ml，抗原液中加入0.5mol/L BEI溶液，使其终浓度为0.002mol/L，37℃条件下灭活24～48小时，加入2mol/L硫代硫酸钠溶液的体积，使其终浓度为0.02mol/L，37℃中和1小时；
[0025]步骤(2)中，加入含本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
1.一种犬瘟热、貉病毒性肠炎二联冻干灭活疫苗，其特征在于成分包括犬瘟热病毒抗原及貉细小病毒抗原。2.如权利要求1所述犬瘟热、貉病毒性肠炎二联冻干灭活疫苗，其特征在于疫苗使用的动物包括貉。3.如权利要求1所述犬瘟热、貉病毒性肠炎二联冻干灭活疫苗，其特征在于疫苗中犬瘟热病毒含量不低于10
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TCID
50
/头份，貉细小病毒含量不低于10
6.0
TCID
50
/头份。4.如权利要求1所述犬瘟热、貉病毒性肠炎二联冻干灭活疫苗，其特征在于所述犬瘟热病毒抗原为CDV JTM株，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为：CGMCC No.9905。貉细小病毒抗原为RDPV LT株。5.如权利要求1所述犬瘟热、貉病毒性肠炎二联冻干灭活疫苗，其特征在于抗原灭活方法为：BEA与NaOH按比例混合，环化成BEI，与抗原混合，调节终浓度为0.0005～0.01mol/L，优选为0.002mol/L；30～45℃，优选为37℃，灭活24～48小时；加入硫代硫酸钠溶液使其终浓度为0.005～0.04mol/L，优选为0.02mol/L，进行灭活阻断。6.如权利要求1至5任一所述犬瘟热、貉病毒性肠炎二联冻干灭活疫苗的的制备方法，其特征在于包括以下步骤：(1)犬瘟热病毒灭活抗原制备：选择MDCK细胞，加入无血清营养液培养，使用无血清营养液将细胞密度稀释至4.0
×
106～6.0
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106个/ml，按病毒感染指数(MOI)0.01～0.1接种生产用毒种培养48～72小时，收获病毒液，抗原液中加入BEI溶液，灭活24～48小时，加入硫代硫酸钠溶液中和，即得犬瘟热病毒灭活抗原；(2)貉细小病毒灭活抗原制备；选择CRFK转瓶细胞，用胰酶消化成单个细胞并计数，加入含6％～10％牛血清的MEM或DMEM培养液，培养1～4小时，按MOI为0.05～0.1同步接种RDPV生产毒种，培养，RDPV病毒含量应不低于10
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/ml，抗原液中BEI溶液，灭活24～48小时，加入硫代硫酸钠溶液，中和1小时，即得貉细小病毒灭活抗原；(3)配苗及冻干：将步骤(1)和步骤(2)获得的灭活抗原按比例混合，...
【专利技术属性】
技术研发人员：王宇菲，和彦良，闫喜军，徐涛，吉慧，吴莹莹，
申请(专利权)人：华威特江苏生物制药有限公司，
类型：发明
国别省市：
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