用于血清4型I群禽腺病毒分型鉴定的多肽序列及应用制造技术

本发明专利技术提供了用于血清4型I群禽腺病毒分型鉴定的多肽序列，该多肽序列经免疫印迹实验验证可以与FAdV‑4型阳性血清发生生物学反应，具有生物学活性，与其余血清型的FAdV阳性血清不存在交叉反应。此外，本发明专利技术采用该多肽建立的间接ELISA检测方法可以快速灵敏的鉴定4型禽腺病毒血清抗体，减少非特异性反应引起的假阳性数据，相比较用全病毒或Hexon包被的试剂盒而言具有更好的特异性，能够有效的对4型疫苗的进行免疫评估及识别FAdV‑4型抗体。

Peptide sequence and its application in serotype identification of avian adenovirus group I

【技术实现步骤摘要】
用于血清4型I群禽腺病毒分型鉴定的多肽序列及应用
本专利技术属于兽用生物制品领域，具体涉及用于血清4型I群禽腺病毒分型鉴定的多肽序列及应用。
技术介绍
禽腺病毒(Fowladenovirus,FAdV)属于禽腺病毒科、禽腺病毒属，是引起病鸡突然死亡、严重贫血、黄疸为主要临床症状的急性传染病的病原，而且禽腺病毒还常与一些能导致禽类呼吸道疾病相关的病原微生物混合感染或者在免疫抑制时发生疾病，给禽类养殖业带来巨大的损失。研究显示，禽腺病毒I群分为12个血清型(血清型1-7、8a、8b、9-11)，禽腺病毒的结构蛋白主要是Hexon基因，它是中和抗体的靶目标和主要的保护性抗原基因，与致病性密切相关，经2015-2018年禽腺病毒的分子流行病学调查发现，近两年流行的禽腺病毒毒株在hexon基因的保守区域没有太大变化。经调查发现，在同一养殖场中往往存在几种不同血清型的禽腺病毒，其中以FAdV-4型最为常见，但FAdV-11、FAdV-8a、FAdV-8b呈逐渐扩散的趋势，导致病原复杂，研究者难以确定感染病源，而且目前市场上关于腺病毒的疫苗比较杂乱，因此难以对免疫后的4型FAdV血清抗体分型及抗体水平进行监测。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供用于血清4型I群禽腺病毒分型鉴定的多肽序列，以解决血清4型I群禽腺病毒难以有效鉴定的问题。本专利技术的目的是提供用于血清4型I群禽腺病毒分型鉴定的应用，利用血清4型I群禽腺病毒鉴定的多肽建立的ELISA检测方法，可以灵敏、有效的检测4型FAdV-I的抗体情况。为达到上述目的，本专利技术的技术方案是这样实现的：用于血清4型I群禽腺病毒分型鉴定的多肽序列，所述序列如SEQIDNO:1所示。进一步的，所述多肽序列偶联BSA分子。所述的多肽序列在鉴别血清4型I群禽腺病毒中的应用。一种含有权利要求1和2所述序列的血清4型I群禽腺病毒分型鉴定的ELISA试剂盒，包括：包被抗原、抗原包被液、封闭液、样品稀释液、显色液、二抗、洗涤液、终止液、阴性标准品、阳性标准品。进一步的，所述包被抗原为权利要求2所述的偶联BSA的多肽序列。进一步的，抗原包被液为磷酸盐缓冲液，pH6.0。进一步的，样品稀释液为含有0.5％BSA的磷酸盐缓冲液，pH7.4。进一步的，所述二抗为山羊抗鸡IgG酶标二抗。进一步的，所述终止液为2M的H2SO4溶液。进一步的，所述洗涤液为0.05％PBST，pH7.4。相对于现有技术，本专利技术具有以下优势：本专利技术提供了一段能够鉴定FAdV-4型血清抗体的多肽，该多肽经免疫印迹实验验证可以与FAdV-4型阳性血清发生生物学反应，具有生物学活性，与其余血清型的FAdV阳性血清不存在交叉反应。本专利技术用该多肽建立的间接ELISA检测方法可以快速灵敏的鉴定4型禽腺病毒血清抗体，减少非特异性反应引起的假阳性数据，相比较用全病毒或Hexon包被的试剂盒而言具有更好的特异性，能够有效的对4型疫苗的进行免疫评估及识别FAdV-4型抗体。附图说明构成本专利技术的一部分的附图用来提供对本专利技术的进一步理解，本专利技术的示意性实施例及其说明用于解释本专利技术，并不构成对本专利技术的不当限定。在附图中：图1用于血清4型I群禽腺病毒分型鉴定的多肽序列的SDS-PAGE电泳结果具体实施方式实施例中除特殊注明，其余使用的试剂盒、载体、酶、宿主菌等生物原料均来自商业化产品。实施例1：用于血清4型I群禽腺病毒分型鉴定的多肽序列的合成1.I群禽腺病毒分子流行病学调查及生物合成本研究对2015-2018年国内流行的I群禽腺病毒的进行了分离鉴定，共分离到9个血清型的流行毒株，血清型分别为FAdV-1、FAdV-2、FAdV-3、FAdV-4、FAdV-8a、FAdV-8b、FAdV-9、FAdV-10、FAdV-11，并通过hexon基因测序进行分子生物学分析，与相关参考文献及NCBI上查找的参考毒株对比发现，这9个血清型的hexon基因其抗原位点区存在很明显的差异部分，且FAdV-4型的田间分离株无时间和地域的差异，属于保守区域。将FAdV-4型的这段多肽进行生物合成，其长度为31个氨基酸，等电点为5.99。2.纯净性、特异性及生物学活性鉴定人工合成的多肽为白色固体粉末，使用无菌去离子水即可稀释溶解。将多肽采用免疫印迹方法鉴定其生物学活性及特异性，结果显示该多肽能与FAdV-4型阳性血清发生特异性反应，但与其余血清型的阳性血清会发生交叉反应。因此本研究将多肽与BSA偶联，继而，非特异性反应消除，该多肽与其余血清型的阳性血清不发生交叉反应，我们将该多肽与BSA的偶联产物命名为C-138。本研究将C-138稀释成25mg/ml，于-20℃保存，进行SDS-PAGE鉴定，垂直电泳结果(见图1)显示条带单一纯净，条带大小与预期结果一致。3.多肽(C-138)的稳定性鉴定将多肽(C-138)于-20℃反复冻融三次后进行免疫印迹验证，结果显示反复冻融三次后该多肽存在生物学活性，未出现失活现象。实施例2、FAdV合成多肽间接ELISA检测方法的建立1.间接ELISA最佳反应条件的选择1.1抗原最佳包被液、包被量和最佳稀释度的选择根据合成肽的等电点，分别配制柠檬酸盐、碳酸盐和磷酸盐三种包被液，用包被液将标准抗原稀释成5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60ug/ml，包被96空酶标板(100ul/孔)，每个稀释度包被一列，4℃包被过夜；将FAdV-4阴、阳性血清倍比稀释(1:50,1:100,1:200,1:400)，每个稀释倍数包被一行(100ul/孔)，37℃孵育1h，PBST洗5次，拍干；加入1:1000倍稀释的羊抗鸡IgG-HRP，100ul/孔，37℃孵育1h，PBST洗4次，拍干；加入新配置的TMB显色底物，100ul/孔，避光显色15min。最后加入2mol/L的H2SO4终止反应，50ul/孔，用酶标仪测定OD450。实验重复3次，测定样本平均的OD450，选择阳性血清OD450为1.0左右、阴性血清OD450小于0.1的包被抗原稀释度作为工作浓度。结果说明，PH6.0左右的磷酸盐缓冲液包被多肽最后得到的吸光度值其整体要高于其余两种缓冲液。根据数据显示抗原包被在35ug/ml、血清稀释400倍最佳(见表1)。表1抗原最佳包被浓度和最佳稀释度的确定1.2最佳封闭液及封闭时间的选择选择最佳抗原包被浓度及包被条件包被抗原，分别以5％脱脂乳、2.5％脱脂乳、5％BSA、1％BSA作为封闭液对ELISA板进行封闭，封闭时间选择45min、60、90min、120min，实验分别进行三次重复，测定FAdV-4阴、阳性检测血清的OD450值，以确定最佳封闭液及封闭时间。根据数据显示5％BSA封闭90min时P/N值最大(本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.用于血清4型I群禽腺病毒分型鉴定的多肽序列，其特征在于：所述序列如SEQ IDNO:1所示。/n

【技术特征摘要】
1.用于血清4型I群禽腺病毒分型鉴定的多肽序列，其特征在于：所述序列如SEQIDNO:1所示。


2.根据权利要求1所述用于血清4型I群禽腺病毒分型鉴定的多肽序列，其特征在于，所述多肽序列偶联BSA分子。


3.如权利要求1和2所述的多肽序列在鉴别血清4型I群禽腺病毒中的应用。


4.一种含有权利要求1和2所述序列的血清4型I群禽腺病毒分型鉴定的ELISA试剂盒，其特征在于：所述试剂盒包括：包被抗原、抗原包被液、封闭液、样品稀释液、显色液、二抗、洗涤液、终止液、阴性标准品、阳性标准品。


5.根据权利要求4所述的血清4型I群禽腺病毒分型鉴定的ELISA试剂盒，其特征在于：所述包被抗原为权利要求2所述的偶联BSA的多肽序列。

【专利技术属性】
技术研发人员：李守军，牛登云，马利芳，陈家锃，冯敬敬，段宝敏，
申请(专利权)人：天津渤海农牧产业联合研究院有限公司，
类型：发明
国别省市：天津;12