用于鸡传染性支气管炎病毒基因分型检测的引物及其应用制造技术

本发明专利技术提供了一组用于鸡传染性支气管炎病毒基因分型检测的引物及其应用，属于分子生物学检测技术领域。所述引物包括鸡传染性支气管炎病毒H120型、QX型、LDT3型、4/91型、GVI

【技术实现步骤摘要】
用于鸡传染性支气管炎病毒基因分型检测的引物及其应用


[0001]本专利技术属于分子生物学检测
，具体涉及一组用于鸡传染性支气管炎病毒基因分型检测的引物及其应用。

技术介绍

[0002]鸡传染性支气管炎是一种由冠状病毒科冠状病毒属中的传染性支气管炎病毒(IBV)引发的。病毒主要通过侵害鸡的呼吸道和泌尿生殖系统以及消化器官，从而引发鸡的生长发育缓慢及产蛋率、产蛋质量的下降，临床上多以呼吸道、肾脏病变为主。病毒可通过呼吸道传播，亦可通过带病鸡的粪便传播。
[0003]冠状病毒由于其复制高度依赖RNA聚合酶，而RNA聚合酶其本身缺乏校正修复功能，因此病毒复制时易发生突变与重组，这种插入缺失、点突变、重组在IBV疫苗选择的压力下往往会产生一些新的基因型毒株和重组毒株，导致不同IBV毒株之间出现临床症状的差异，以及伴随众多血清型的产生IBV毒株交叉保护效果差甚至完全丧失保护能力。有报道称目前全球已超过50种不同血清型IBV，且国内外流行毒株不一，变异程度不同，这些都给IBV防控带来了严峻的挑战。由于IBV血清型呈不断增多的态势，使得血清型分型方法在实际应用中受限。因此，通过对病毒S1基因来进行基因分型的方法显得更为直接，这种方法可以让我们快速、准确的了解IBV不同地区的流行情况，从而更有针对性的制定相应的防控策略。
[0004]各个国家对IBV均有一些特定的地方分型方法，大部分的IBV基因型自1931年从美国首次发现后陆续在全世界被发现。虽然到目前为止，疫苗接种被认为是针对IBV最为有效的控制措施。然而，由于新型毒株的持续变异，目前的疫苗已被发现对于部分新型毒株无免疫反应。因此，能够快速、精准的鉴定出IBV的基因型对于该病的防控显得尤为重要，本领域急需开发一种能够更加快速、准确检测鸡传染性支气管炎病毒不同基因型毒株的RT
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PCR分型的方法。本专利技术充分克服了现有技术手段的不足，提供了一种检测鸡传染性支气管炎病毒基因分型的扩增引物组，为IBV防控提供技术支持。
[0005]专利CN 115323075 A公开了一种检测鸡传染性支气管炎病毒及基因分型的RT
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RAA引物探针组、试剂盒及其应用，该方法使用了重组酶介导等温核酸扩增技术，相较于RT
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PCR具有检测时间短、特异性强的优势。本专利技术相较而言，补充了IBV主要流行毒株共5个基因型的全部扩增引物组，覆盖范围更广，且具有很强的特异性、成本较低的优势，可以适用于大批量样本的监测；专利CN 105463136 A公开了一种用于鸡传染性支气管炎病毒RT
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PCR分型检测的试剂盒，该方法首次使用一次性RT
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PCR的方法实现对肾型、4/91类型、呼吸型三种类型IBV毒株的鉴别检测，与本专利技术所涉及检测的IBV基因型分类不同。本专利技术相较而言，更进一步的可以快速、准确的区分肾型及呼吸型IBV的毒株基因型，也是目前国内首次公开的涉及到GVI
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1型IBV检测的扩增引物组。

技术实现思路

[0006]本专利技术克服了现有技术中的不足，提供了一组用于鸡传染性支气管炎病毒基因分
型检测的引物及其应用。
[0007]本专利技术的目的通过下述技术方案予以实现。
[0008]本专利技术第一方面，提供了一组用于鸡传染性支气管炎病毒基因分型检测的引物，所述引物包括鸡传染性支气管炎病毒H120型、QX型、LDT3型、4/91型、GVI
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1型的扩增引物。
[0009]所述H120型的引物序列如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示。
[0010]所述QX型的引物序列如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示。
[0011]所述LDT3型的引物序列如SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示。
[0012]所述4/91型的引物序列如SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8所示。
[0013]所述GVI
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1型的引物序列如SEQ ID NO.9和SEQ ID NO.10所示。
[0014]所述引物序列如下：
[0015][0016][0017]所述引物是通过对GenBank中公布的IBV的H120、QX、LDT3、4/91、GVI
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1等分型的多个毒株S1基因序列进行比较分析，找出相对保守区和特异区设计而成，是型特异性的引物，不会对其他基因型鸡传染性支气管炎病毒产生交叉反应。
[0018]本专利技术的第二方面，提供了一组用于鸡传染性支气管炎病毒基因分型检测的引物在制备鸡传染性支气管炎病毒检测试剂中的应用。
[0019]本专利技术的第三方面，提供了一种含有所述用于鸡传染性支气管炎病毒基因分型检测的引物的检测试剂盒。
[0020]本专利技术的第四方面，提供了一种鸡传染性支气管炎病毒不同基因型毒株的RT
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PCR分型检测方法，包括以下步骤：
[0021](1)提取待检样品的RNA；
[0022](2)使用所述的用于鸡传染性支气管炎病毒基因分型检测的引物对步骤(1)中所得RNA进行RT
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PCR扩增；
[0023](3)对扩增产物进行电泳检测。
[0024]进一步地，步骤(2)中所述的RT
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PCR扩增体系为：
[0025]采用一步法RT
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PCR反应体系，体系总体积为25μl，反应体系的组成为：5.5μl的灭菌水、12.5μl的2xTransTaq PCR Supermix、1μl浓度为10μM的上游引物、1μL浓度为10μM的下游引物、5μl的样品RNA提取液。
[0026]进一步地，步骤(2)中所述的RT
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PCR扩增反应程序为：
[0027]第一步，反转录50℃、时间30min；
[0028]第二步，预扩增94℃、时间5min；
[0029]第三步，扩增94℃、时间30s；
[0030]第四步，退火54
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60℃(H120/QX为55℃、LDT3为54℃、4/91为57℃、GVI
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1为60℃)、时间30s；
[0031]第五步，扩增72℃、时间42s；
[0032]进行所述第一步至所述第五步35个循环后，再扩增72℃延伸5min。
[0033]进一步地，步骤(3)中所述的电泳检测方法为琼脂糖凝胶电泳，具体步骤为：取步骤(3)中RT
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PCR扩增产物8μl，在1.5％琼脂糖凝胶上进行电泳，5V/cm电泳30min，在紫外检测仪观察到不同大小的核酸片段。
[0034]进一步地，步骤(3)中电泳检测结果为：所述H120型的引物扩增获得的产物片段大小为653bp，所述QX型的引物扩增获得的产物片段大小为339bp，所述LDT3型的引物扩增获得的PCR产物片段大小为519bp，所述4/91型的本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一组用于鸡传染性支气管炎病毒基因分型检测的引物，其特征在于，所述引物包括鸡传染性支气管炎病毒H120型、QX型、LDT3型、4/91型、GVI
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1型的扩增引物；其中，所述H120型的引物序列如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示；所述QX型的引物序列如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示；所述LDT3型的引物序列如SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示；所述4/91型的引物序列如SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8所示；所述GVI
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1型的引物序列如SEQ ID NO.9和SEQ ID NO.10所示。2.如权利要求1所述的一组用于鸡传染性支气管炎病毒基因分型检测的引物在制备检测鸡传染性支气管炎病毒检测试剂中的应用。3.含有如权利要求1所述的一组用于鸡传染性支气管炎病毒基因分型检测的引物的检测试剂盒。4.一种鸡传染性支气管炎病毒不同基因型毒株的RT
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PCR分型检测方法，包括以下步骤：(1)提取待检样品的RNA；(2)使用权利要求1中所述的用于鸡传染性支气管炎病毒基因分型检测的引物对步骤(1)中所得RNA进行RT
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PCR扩增；(3)对扩增产物进行电泳检测。5.根据权利要求4所述的检测方法，其特征在于，步骤(2)中所述的RT
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PCR扩增体系为一步法RT
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PCR反应体系，反应体系总体积为25μL；所述反应体系的组成为：5.5μL的灭菌水、12.5μL的2xTransTaqPCRSupermix、1μL...

【专利技术属性】
技术研发人员：吕钊，冯敬敬，王友，刘爱玲，牛登云，
申请(专利权)人：天津渤海农牧产业联合研究院有限公司，
类型：发明
国别省市：