一种吡丙醚、非泼罗尼及其代谢物的检测方法与应用技术

本发明专利技术公开了一种吡丙醚、非泼罗尼及其代谢物的检测方法，属于生物样品检测技术领域。本发明专利技术方法采用乙腈

【技术实现步骤摘要】
一种吡丙醚、非泼罗尼及其代谢物的检测方法与应用


[0001]本专利技术属于生物样品检测
，具体涉及一种吡丙醚、非泼罗尼及其代谢物的检测方法与应用。

技术介绍

[0002]吡丙醚(Pyriproxyfen)又称灭幼宝、蚊蝇醚，化学名4
‑
苯氧苯基(RS)
‑2‑
(2
‑
吡啶基氧)丙基醚，是一种新型昆虫生长调节剂，由日本住友化学工业株式会社研发的一类烷氧吡啶保幼激素类几丁质合成抑制剂，具有抑制蚊、蝇幼虫化蛹和羽化作用。
[0003]非泼罗尼(Fipronil)又名氟虫腈，商品名为锐劲特，化学名为5
‑
氨基
‑3‑
氰基
‑1‑
(2,6
‑
二氯
‑4‑
三氟甲苯基)
‑4‑
三氟甲基亚磺酰基吡唑，是法国Rhone
‑
Poulenc公司于1987年开发的一种新型苯基吡唑类杀虫剂，具有杀虫、杀螨、杀线虫和杀节肢动物作用。其在昆虫和哺乳动物体内的主要代谢产物非泼罗尼砜通过阻断哺乳动物和昆虫神经元中γ
‑
氨基丁酸和谷氨酸激活的氯离子通道而继续发挥杀虫活性。
[0004]吡丙醚和非泼罗尼常广泛应用于农药和卫生杀虫剂，近年来被开发用于宠物抗寄生虫药。而药物开发及新药申报工作中，均需开展吡丙醚和非泼罗尼在动物体内药物代谢动力学研究。吡丙醚属于脂溶性药物，在血液中浓度较低，在毛发中的浓度较高。非泼罗尼及其代谢物非泼罗尼砜在血液和毛发两种基质中的浓度同样相差较大。因此，分别考察吡丙醚、非泼罗尼及其代谢物非泼罗尼砜在血液和毛发中药物代谢特征尤为必要。目前，检测吡丙醚的方法有高效液相色谱串联质谱法和气相色谱串联质谱法；非泼罗尼和非泼罗尼砜的检测方法有高效液相色谱串联质谱法、高效液相色谱法和气相色谱串联质谱法。现有技术中均未见报道同时检测血浆和毛发等活体动物的生物样本中吡丙醚和非泼罗尼及其代谢物的方法。因此，亟需建立一种检出限低，线性范围大，能同时检测宠物，尤其是犬血浆和毛发中吡丙醚、非泼罗尼和非泼罗尼砜的检测方法来弥补现有技术的空白，为动物用药后生物样本中吡丙醚、非泼罗尼及其代谢物的浓度检测提供了方法参考依据。

技术实现思路

[0005]本专利技术旨在解决现有技术中的技术问题，提供一种吡丙醚、非泼罗尼及其代谢物非泼罗尼砜的检测方法与应用。本专利技术方法检测成本低，节约时间，可有效除蛋白，降低基质效应，简化净化步骤。采用高效液相色谱
‑
串联质谱法，相比于高效液相色谱法，具有灵敏度高，重复性好，检出限低、准确度高且能实现同时检测多种药物的优势。
[0006]为达到以上目的，本专利技术具体技术方案如下：
[0007]本专利技术第一方面，提供了一种吡丙醚、非泼罗尼及其代谢物的检测方法，所述代谢物为非泼罗尼砜，主要包括步骤(1)生物样品的前置处理和步骤(2)使用高效液相色谱
‑
质谱联用法进行检测。
[0008]步骤(1)中所述生物样品前置处理的具体步骤为，向待测生物样品中依次加入内标工作液和提取液，充分混合，离心取上清，过滤，得待测液。
[0009]所述提取液中乙腈与甲醇的体积比为(7
‑
10):(3
‑
0)；优选提取液中乙腈与甲醇的体积比为9:1。
[0010]优选地，所述生物样品选自毛发或血浆。
[0011]优选地，所述内标工作液为乙虫腈内标溶液。
[0012]所述血浆样品中的吡丙醚、非泼罗尼及其代谢物的提取方法为：向血浆样品中加入乙虫腈内标溶液及乙腈
‑
甲醇提取液，涡旋振荡，充分混匀，离心，取上清，过滤，取滤液，得待测液。
[0013]优选地，所述血浆与提取液的体积比为20:59，所述内标溶液与提取液的体积比为1:59；所述乙虫腈内标溶液的浓度为20μg/mL。
[0014]优选地，所述离心的条件为12000r/min离心10min；所述过滤采用0.22μm尼龙滤膜。
[0015]所述毛发样品中的吡丙醚、非泼罗尼及其代谢物的提取方法为：向毛发样品中加入乙虫腈内标溶液，破碎，加入乙腈
‑
甲醇提取液，超声，离心，取上清，过滤，得待测液。
[0016]优选地，所述毛发与提取液的质量体积比约为1:0.095(mg:mL)，内标溶液与提取液的体积比为1:19；所述乙虫腈内标溶液的浓度为20μg/mL。
[0017]优选地，所述超声条件为30℃超声30min；所述过滤采用0.22μm尼龙滤膜；所述破碎条件为70Hz破碎120s，所述离心的条件为12000r/min离心5min。
[0018]步骤(2)中所述高效液相色谱
‑
质谱联用法的质谱参数如下：离子源ESI源；离子源温度：350℃；Gas Flow：10L/min；优选质谱参数中的离子源温度为350℃。
[0019]所述高效液相色谱条件为：流动相A为乙腈，流动相B为水；色谱柱为ACQUITY BEH C18(1.7μm，2.1
×
50mm)，柱温为40℃，流速为0.2mL/min，进样量为2μL；优选所述流动相中乙腈纯度为质谱级，流动相比例为A:B＝70:30，所述柱温为40℃。
[0020]本专利技术另一方面，还提供了一种吡丙醚、非泼罗尼及其代谢物的检测方法在检测动物活体的生物样本中吡丙醚、非泼罗尼及其代谢物的应用。
[0021]优选地，所述动物活体的生物样本为宠物的毛发或血浆。
[0022]优选宠物为犬。
[0023]在上述方案的基础上，优选的一种吡丙醚、非泼罗尼及其代谢物的检测方法步骤如下：
[0024](1)生物样品的前置处理：取血浆200μL，依次加入20μg/mL的乙虫腈内标工作液10μL和乙腈
‑
甲醇提取液590μL，涡旋振荡1min，充分混匀，12000r/min离心10min，取上清液，0.22μm尼龙滤膜过滤，得到待测液备用；
[0025]或，取毛发约50mg，加入20μg/mL的乙虫腈内标工作液0.25mL，70Hz破碎120s，加入乙腈
‑
甲醇提取液4.75mL，30℃超声30min后，12000r/min离心5min，取上清液，0.22μm尼龙滤膜过滤，得到待测液备用。
[0026](2)高效液相色谱
‑
质谱联用检测方法：
[0027]高效液相色谱质谱联用仪：Agilent 6420Triple Quad LC/MS；
[0028]质谱参数：离子源ESI源；离子源温度：350℃；Gas Flow：10L/min。
[0029]色谱条件：
[0030]色谱柱：Waters，ACQUITYBEH C18(1.7μm，2.1
×
50mm)；
[0031]柱温为40℃；
[0032]流速为0.2本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种吡丙醚、非泼罗尼及其代谢物的检测方法，其特征在于，使用乙腈
‑
甲醇作为提取液提取生物样品中的吡丙醚、非泼罗尼及其代谢物非泼罗尼砜；具体步骤为，向待测样品中依次加入内标工作液和提取液，充分混合，离心取上清，过滤，得待测液，采用高效液相色谱
‑
串联质谱法进行检测；所述提取液中乙腈与甲醇的体积比为7
‑
10:3
‑
0。2.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述提取液中乙腈与甲醇的体积比为9:1。3.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述生物样品为毛发或血浆；所述内标工作液为乙虫腈内标溶液。4.根据权利要求3所述的检测方法，其特征在于，所述血浆样品中的吡丙醚、非泼罗尼及其代谢物的提取方法为：向血浆样品中加入内标溶液及提取液，涡旋振荡，充分混匀，离心，取上清，过滤，得待测液；所述毛发样品中的吡丙醚、非泼罗尼及其代谢物的提取方法为：向毛发样品中加入内标溶液，破碎，加入提取液，超声，离心，取上清，过滤，得待测液。5.根据权利要求4所述的检测方法，其特征在于，所述血浆与提取液的体积比为20:59，所述内标溶...

【专利技术属性】
技术研发人员：侯亚婷，杨莹莹，李守军，刘爱玲，张玉良，欧亚红，刘梦月，孟小宾，张晓鹏，
申请(专利权)人：天津渤海农牧产业联合研究院有限公司，
类型：发明
国别省市：