抑制新型冠状病毒基因表达的shRNA的筛选方法及其用途技术

本发明专利技术公开了抑制新型冠状病毒基因表达的shRNA的筛选方法及其用途，涉及遗传工程涉及的DNA或RNA领域。本发明专利技术所要解决的技术问题是如何安全、快速和/或低成本地筛选能有效抑制新冠病毒N、M和S基因表达的shRNA。本发明专利技术提供的筛选抑制新型冠状病毒基因表达的shRNA的方法包括：A1)构建表达新型冠状病毒的N基因、M基因和部分S基因的动物模型；A2)利用所述动物模型筛选待测shRNA是否为抑制新型冠状病毒基因表达的shRNA。本发明专利技术能快速建立新冠病毒目的基因表达的模型，用于筛选治疗新型冠状病毒感染的RNA干扰类药物，避免了用新冠感染的动物进行小核酸药物筛选的风险。物进行小核酸药物筛选的风险。

【技术实现步骤摘要】
抑制新型冠状病毒基因表达的shRNA的筛选方法及其用途


[0001]本专利技术涉及遗传工程涉及的DNA或RNA领域，具体涉及抑制新型冠状病毒基因表达的shRNA的筛选方法及其用途。

技术介绍

[0002]新型冠状病毒(SARS
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CoV
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2)隶属冠状病毒的β亚属，为单股正链的RNA病毒，基因组约为30KB，由内部的遗传物质RNA以及刺突蛋白(Spike Protein，S蛋白)、包膜蛋白(Envelope Protein，E蛋白)、膜蛋白(Membrane Protein，M蛋白)和核衣壳蛋白(Nucleoprotein，N蛋白)等构成。病毒里面是负责病毒繁殖的核酸物质RNA，它由核衣壳蛋白包裹并保护着。在这四种蛋白中，最重要的就是刺突蛋白(S蛋白)，S蛋白是形成病毒“冠状”形态的主要蛋白之一，介导SARS
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CoV
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2进入细胞，是病毒感染宿主细胞的武器。SARS
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CoV
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2的遗传物质为RNA，容易在复制过程中出错，大量复制可引起多种变异，导致该病毒存在较高的突变能力，一旦出现一种适应性好的变异株，则可能引起广泛传播。目前已经产生多种突变型，随着突变型的不断产生，其毒性和传播能力也不断改变。有研究显示德尔塔毒株相较于野生型的病毒载量提高了1000倍以上，这也增加了其转染能力提高的风险。越来越多的突变毒株产生多种多样的后果，包括传播加速和致病力改变等，导致早期研发的药物失效或治疗效果大大降低。因此，亟需进一步研究和开发更为安全、有效的靶向新型冠状病毒的临床治疗药物。
[0003]RNA干扰(RNA interference，RNAi)技术是目前较为成熟的降低目的基因表达的方法之一。RNAi是指外源双链RNA(double
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stranded RNA，dsRNA)在细胞内特异地诱导与之同源互补的mRNA降解，使相应基因的表达沉寂关闭，从而引发转录后基因沉默(post
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transcription gene silencing，PTGS)的现象。利用RNAi技术可直接抑制病毒基因的表达和复制，从而抑制病毒的侵染。随着近几年基因测序和靶向运载技术的不断进步，RNAi药物稳步发展，在抗病毒、抗肿瘤等领域具有巨大潜力。RNAi药物可以对抗侵入病毒的作用，抑制其复制，减弱或消除其基因毒性，相比于单克隆抗体药物，RNAi药物可真正实现基因层面的治本效果，此外RNAi药物可以通过合成获得，生产和纯化更容易实现。短发夹RNA(short hairpin RNA，shRNA)是设计为能够形成发夹结构的非编码小RNA分子，因其具有特殊的茎环结构，在哺乳动物细胞中可以长期甚至稳定地发挥RNA干扰作用，而不引起非特异性反应。由于shRNA序列较短和设计方便的特性，shRNA介导的RNA干扰技术能广泛的应用在不同的载体上递送到各种细胞中实现长期抑制目的基因表达的目的。

技术实现思路

[0004]本专利技术所要解决的技术问题是如何安全、快速和/或低成本地筛选能有效抑制新型冠状病毒N、M和S基因表达的shRNA。所要解决的技术问题不限于所描述的技术主题，本领域技术人员通过以下描述可以清楚地理解本文未提及的其它技术主题。
[0005]为解决上述技术问题，本专利技术首先提供了筛选抑制新型冠状病毒基因表达的
shRNA的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：
[0006]A1)构建表达新型冠状病毒的N基因、M基因和部分S基因的动物模型；
[0007]A2)利用所述动物模型筛选待测shRNA是否为抑制新型冠状病毒基因表达的shRNA，所述待测shRNA的靶点为所述N基因、所述M基因和所述部分S基因。
[0008]所述筛选抑制新型冠状病毒基因表达的shRNA的方法可为鉴定或辅助鉴定抑制新型冠状病毒基因表达的shRNA(即鉴定或辅助鉴定待测shRNA干扰靶基因表达的效果)的方法。
[0009]所述待测shRNA可为串联shRNA，所述串联shRNA包括分别针对N基因、M基因和部分S基因设计的shRNA。
[0010]上述方法中，所述N基因的核苷酸序列可为SEQ ID No.1的第1
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669位，所述M基因的核苷酸序列可为SEQ ID No.1的第670
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1929位，所述部分S基因的核苷酸序列可为SEQ ID No.1的第1930
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2179位。
[0011]上述方法中，所述A1)可包括如下步骤：
[0012]B1)重组腺相关病毒AAV
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NMS的构建：将所述N基因、所述M基因和所述部分S基因串联，得到名称为NMS基因的DNA分子，将所述NMS基因克隆到腺相关病毒表达载体中，得到重组腺相关病毒表达载体，将所述重组腺相关病毒表达载体、辅助质粒和包装质粒共转染包装细胞，得到重组腺相关病毒AAV
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NMS；
[0013]B2)动物模型的制备：用所述重组腺相关病毒AAV
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NMS感染动物，得到表达新型冠状病毒N基因、M基因和部分S基因的动物模型。
[0014]进一步地，上述方法中，所述将N基因、M基因和部分S基因串联可以是将N基因、M基因和部分S基因直接连接，也可以是通过接头连接。
[0015]上述方法中，所述NMS基因的核苷酸序列可为SEQ ID No.1。
[0016]进一步地，上述方法中，所述辅助质粒可为pHelper。
[0017]进一步地，上述方法中，所述包装质粒可为pRep2CapX。
[0018]进一步地，上述方法中，所述包装细胞可为人胚肾细胞HEK293。
[0019]进一步地，上述方法中，所述动物可为小鼠。
[0020]进一步地，所述小鼠可为3
‑
5周龄小鼠。
[0021]进一步地，上述方法中，B2)中所述感染动物(小鼠)的方法可为滴鼻方法。
[0022]进一步地，所述滴鼻方法中，所述重组腺相关病毒AAV
‑
NMS浓度为4
×
10
12
G/ml，滴鼻的量为100μl/只。
[0023]本专利技术还提供了上述方法所构建的表达新型冠状病毒N基因、M基因和部分S基因的动物模型的下述任一种应用：
[0024]E1)在筛选抑制新型冠状病毒基因的shRNA中的应用；
[0025]E2)在筛选治疗新型冠状病毒感染引起的疾病(如新型冠状病毒感染)的RNA干扰类药物中的应用；
[0026]E3)在筛选治疗新型冠状病毒感染引起的疾病的能用于动物实验和临床实验的AAV制剂中的应用。
[0027]上述方法中，所述A2)可包括如下步骤：
[0028]C1)将表达所述待测shRNA的DNA分子克隆到腺相关病毒表达载体中，得到重组腺
No.45)，核苷酸序列为SEQ ID 本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.筛选抑制新型冠状病毒基因表达的shRNA的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：A1)构建表达新型冠状病毒的N基因、M基因和部分S基因的动物模型；A2)利用所述动物模型筛选待测shRNA是否为抑制新型冠状病毒基因表达的shRNA，所述待测shRNA的靶点为所述N基因、所述M基因和所述部分S基因。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述N基因的核苷酸序列为SEQ ID No.1的第1
‑
669位，所述M基因的核苷酸序列为SEQ ID No.1的第670
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1929位，所述部分S基因的核苷酸序列为SEQ ID No.1的第1930
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2179位。3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述A1)包括如下步骤：B1)重组腺相关病毒AAV
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NMS的构建：将所述N基因、所述M基因和所述部分S基因串联，得到名称为NMS基因的DNA分子，将所述NMS基因克隆到腺相关病毒表达载体中，得到重组腺相关病毒表达载体，将所述重组腺相关病毒表达载体、辅助质粒和包装质粒共转染包装细胞，得到重组腺相关病毒AAV
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NMS；B2)动物模型的制备：用所述重组腺相关病毒AAV
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NMS感染动物，得到表达新型冠状病毒N基因、M基因和部分S基因的动物模型。4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述NMS基因的核苷酸序列为SEQ ID No.1。5.根据权利要求1
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4中任一所述的方法，其特征在于，所述A2)包括如下步骤：C1)将表达所述待测shRNA的DNA分子克隆到腺相关病毒表达载体中，得到重组腺相关病毒表达载体，将所述重组腺相关病毒表达载体、辅助质粒和包装质粒共转染包装细胞，得到重组腺相关病毒scAAV
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shRNA；C2)用所述重组腺相关病毒scAAV
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shRNA感染所述动物模型；C3)检测所述动物模型中所述N基因、所述M基因和/或所述部分S基因的表达水平，根据所述表达水平筛选抑制新型冠状病毒基因表达的...

【专利技术属性】
技术研发人员：张雅鸥，张世宽，
申请(专利权)人：苏州吉玛基因股份有限公司，
类型：发明
国别省市：