异常凝血酶原化学发光免疫检测试剂盒及其制备方法技术

异常凝血酶原化学发光免疫检测试剂盒及其制备方法，属于体外检测领域，该试剂盒包括：链霉亲和素磁颗粒、化学发光标记物标记的异常凝血酶原单克隆抗体、偶联标记物标记的异常凝血酶原单克隆抗体、化学发光激发液、异常凝血酶原校准品。链霉亲和素磁颗粒中磁颗粒浓度0.01～1％，粒径0.05～3μm。异常凝血酶原单克隆抗体与化学发光标记物的摩尔比为1:1～20。异常凝血酶原单克隆抗体与偶联标记物的摩尔比为1:1～50。化学发光标记物为吖啶酯、鲁米诺、异鲁米诺或三联吡啶钌。偶联标记物为生物素。本发明专利技术灵敏度高，特异性强，准确性高，检测时间短，操作方便。

Abnormal prothrombin chemiluminescence immunoassay kit and its preparation

【技术实现步骤摘要】
异常凝血酶原化学发光免疫检测试剂盒及其制备方法
本专利技术属于体外检测
，具体涉及一种异常凝血酶原化学发光免疫检测试剂盒及其制备方法。
技术介绍
PIVKA-II是一种维生素K缺乏诱导蛋白，又被称为异常凝血酶原，最初于1984年由Liebman从肝细胞癌患者的血清中发现，是肝细胞癌的产物，凝血酶原在维生素K充足情况下由肝脏合成，其主要有四个功能域：1个γ-羧基谷氨酸区(Gla区)，2个环状(Kringlek区)和1个催化区。正常凝血酶原是在肝细胞微粒体内主要依赖维生素K的γ-谷氨酰羧化酶及辅酶VitaminK-epoxide-reductase和VitaminK-reductase参与下，将结构Gla区中的第6，7，14，16，19，20，25，26，29和32位的10个Glu残基羧化为Gla，使之成为有活性的凝血酶原，上述任何位点的一个或多个Glu残基羧化不全，都将可能形成PIVKA-II，从而失去与钙离子和磷脂的结合能力，丧失凝血活性。肝癌(HCC)因缺少早期的诊断指标，有50％的患者出现临床症状时的检验结果都处于临床晚期，5年存活率低于10％。乙肝病毒感染是肝癌发病的主要原因，HCC早期诊断的血清标志物一直是研究关注的热点，甲胎蛋白AFP是HCC检测最常用的标志物，其检测敏感性仅为60％～70％，但约18％的肝癌AFP不升高，早期肝癌AFP的假阴性率高达40％，可能因为某些类型的肝癌早期并不表达AFP，或者AFP含量与肿瘤体积大小有关。此外，在筛选有慢性病毒性肝炎背景下的HCC时，AFP的特异性和敏感性相对较低，其假阴性和假阳性均影响HCC的正确诊断，而且AFP在一些良性肝病、部分生殖系统和胃肠道的恶性肿瘤患者的血清中也会升高，从而影响临床诊断结果。临床研究表明，PIVKA-II与多种HCC恶性增值途径相关，其可能在HCC的发展、浸润与转移等方面促进肝细胞的恶性增值，AFP与PIVKA-II联合诊断，可以将HCC诊断的敏感度和特异性提高8～20％。目前测定异常凝血酶原的方法有放射免疫分析法(RIA)、酶免疫分析法(EIA)、化学发光免疫法法(CLEIA)等。然而，EIA法尤其局限性，特异性差、灵敏度低、准确性不高等。放射性免疫方法虽然被认为是准确可靠的方法，但是放射性同位素的辐射影响，废物处理需要专门的实验室，成本高和半衰期短的弊端，已经使该方法逐渐遭到淘汰。
技术实现思路
目前市面上检测异常凝血酶原常用的方法是酶免疫分析法和放射免疫分析法，由于两种方法存在固有缺点即灵敏度低、特异性差、线性范围窄以及抗干扰能力差导致测量结果不准确，而放射性免疫对实验室的要求也造成了实验成本高的问题，为了解决上述问题，本专利技术提供一种异常凝血酶原化学发光免疫检测试剂盒及其制备方法，其采用链霉亲和素磁珠-生物素标记抗体-吖啶酯标记抗体体系进行PIVKA-II的检测，具有较高的灵敏度和特异性，准确性更高，检测时间更短，操作更方便。本专利技术为解决技术问题所采用的技术方案如下：本专利技术的异常凝血酶原化学发光免疫检测试剂盒，包括：链霉亲和素磁颗粒、化学发光标记物标记的异常凝血酶原单克隆抗体、偶联标记物标记的异常凝血酶原单克隆抗体。作为优选的实施方式，所述链霉亲和素磁颗粒中，磁颗粒的浓度为0.01～1％，磁颗粒的粒径为0.05～3μm。作为优选的实施方式，所述化学发光标记物标记的异常凝血酶原单克隆抗体中，异常凝血酶原单克隆抗体与化学发光标记物的摩尔比为1:1～20。作为优选的实施方式，所述化学发光标记物为吖啶酯、鲁米诺、异鲁米诺或三联吡啶钌。作为优选的实施方式，所述偶联标记物标记的异常凝血酶原单克隆抗体中，异常凝血酶原单克隆抗体与偶联标记物的摩尔比为1:1～50。作为优选的实施方式，所述偶联标记物为生物素。作为优选的实施方式，还包括化学发光激发液，所述化学发光激发液包括A液和B液，所述A液为硝酸和过氧化氢溶液，B液为氢氧化钠溶液。作为优选的实施方式，还包括异常凝血酶原校准品，所述异常凝血酶原校准品的浓度分别为0.00mAU/mL、40.00mAU/mL、100.00mAU/mL、300.00mAU/mL、5000.00mAU/mL和30000.00mAU/mL。本专利技术的异常凝血酶原化学发光免疫检测试剂盒的制备方法，包括以下步骤：步骤一、制备链霉亲和素磁颗粒取浓度50～100mg/mL的链霉亲和素磁颗粒溶液0.5～1mL，加入5～10mLTBST溶液混匀后，置于磁分离器上分离磁颗粒，直至上清无混浊，弃上清，留取磁颗粒；重复清洗3次后，加入缓冲液A配制成磁颗粒浓度为0.01～1％的固相试剂，即得链霉亲和素磁颗粒，2～8℃保存备用；步骤二、制备化学发光标记物标记的异常凝血酶原单克隆抗体将化学发光标记物溶解于DMF溶液中，按照异常凝血酶原单克隆抗体与化学发光标记物摩尔比为1:1～20的比例加入异常凝血酶原单克隆抗体进行标记，加入标记缓冲液，避光反应2～6h；步骤三、制备偶联标记物标记的异常凝血酶原单克隆抗体将偶联标记物溶解于DMF溶液中，按照异常凝血酶原单克隆抗体与偶联标记物摩尔比为1:1～50的比例加入异常凝血酶原单克隆抗体进行标记，加入标记缓冲液，避光反应2～6h。作为优选的实施方式，步骤一中，所述缓冲液A由浓度为50mM的MES溶液、0.05％吐温-20和0.05％Proclin300组成，pH为7.4。作为优选的实施方式，步骤二和步骤三中，标记缓冲液为PB缓冲液，pH为7.4，浓度为20mmol/L。作为优选的实施方式，所述化学发光标记物和偶联标记物的浓度均为2mg/mL。本专利技术的有益效果是：本专利技术的异常凝血酶原化学发光免疫检测试剂盒相比传统的检测方法，抗原、抗体的结合是在相似的液体条件下进行，反应过程更简洁、反应迅速灵敏、线性范围更宽以及特异性更好；另一方面，PIVKA-II化学发光免疫测试剂盒与化学发光免疫检测仪器组成封闭系统，试剂、样本的添加及检测任务均由仪器自动完成，降低了人为操作的误差，提高了整个系统的灵敏度与准确度。与现有技术相比，本专利技术具有以下优点：1、选择吖啶酯为化学发光免疫分析系统的标记材料，该材料有激发态回到基态时产生的能量跃迁为直接化学发光，不需要酶的参与，节约时间及成本。2、采用链霉亲和素磁珠与生物素标记的类似物可以牢牢的结合在一起，减少非特异性吸附，提高测试样本的准确度，抗干扰能力强。3、异常凝血酶原化学发光免疫检测试剂盒为全自动的测量样本，并直接给出数值，减少人为操作误差，并且实现无人值守。4、吖啶酯的化学发光免疫分析系统线性范围宽。5、试剂与仪器组成封闭系统，系统误差小。6、化学发光免疫检测试剂盒在准确度方面可以替代市面传统试剂盒，为客户提供更加准确的测量数据及低廉的测试成本。附图说明图1为本专利技术的异常凝血酶原化学发光免疫检测试剂盒的制备方法的流程设图。图2为本专利技术的异常凝血酶原化学本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.异常凝血酶原化学发光免疫检测试剂盒，其特征在于，包括：链霉亲和素磁颗粒、化学发光标记物标记的异常凝血酶原单克隆抗体、偶联标记物标记的异常凝血酶原单克隆抗体。/n

【技术特征摘要】
1.异常凝血酶原化学发光免疫检测试剂盒，其特征在于，包括：链霉亲和素磁颗粒、化学发光标记物标记的异常凝血酶原单克隆抗体、偶联标记物标记的异常凝血酶原单克隆抗体。


2.根据权利要求1所述的异常凝血酶原化学发光免疫检测试剂盒，其特征在于，所述链霉亲和素磁颗粒中，磁颗粒的浓度为0.01～1％，磁颗粒的粒径为0.05～3μm。


3.根据权利要求1所述的异常凝血酶原化学发光免疫检测试剂盒，其特征在于，所述化学发光标记物标记的异常凝血酶原单克隆抗体中，异常凝血酶原单克隆抗体与化学发光标记物的摩尔比为1:1～20；所述化学发光标记物为吖啶酯、鲁米诺、异鲁米诺或三联吡啶钌。


4.根据权利要求1所述的异常凝血酶原化学发光免疫检测试剂盒，其特征在于，所述偶联标记物标记的异常凝血酶原单克隆抗体中，异常凝血酶原单克隆抗体与偶联标记物的摩尔比为1:1～50；所述偶联标记物为生物素。


5.根据权利要求1所述的异常凝血酶原化学发光免疫检测试剂盒，其特征在于，还包括化学发光激发液，所述化学发光激发液包括A液和B液，所述A液为硝酸和过氧化氢溶液，B液为氢氧化钠溶液。


6.根据权利要求1所述的异常凝血酶原化学发光免疫检测试剂盒，其特征在于，还包括异常凝血酶原校准品，所述异常凝血酶原校准品的浓度分别为0.00mAU/mL、40.00mAU/mL、100.00mAU/mL、300.00mAU/mL、5000.00mAU/mL和30000.00mAU/mL。


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【专利技术属性】
技术研发人员：王凯，孟令敏，韩美玉，张丹丹，高威，孙成艳，何浩会，
申请(专利权)人：迪瑞医疗科技股份有限公司，
类型：发明
国别省市：吉林;22