本发明专利技术公开了一种同时检测基质金属蛋白酶‑9和2的系统及其制备方法和应用，该系统包括聚多巴胺纳米微球‑修饰荧光素的核酸适配体纳米传感器和脱氧核糖核酸酶，其中传感器由MMP‑9‑aptamer‑FAM和MMP‑2‑aptamer‑Texas Red，加入到聚多巴胺纳米微球中形成。本发明专利技术制备了猝灭效应优良的聚多巴胺纳米微球，通过非公价键结合构建了PDANS‑修饰荧光素的核酸适配体纳米传感器，加入DNase‑I，水解aptamer，待测物游离，循环反应，实现荧光信号放大，提高了系统的灵敏度。本发明专利技术制备简单，反应条件温和，且成本低廉，为基质金属蛋白酶‑9和2同时快速检测提供了一种新的工具和新的方法。
A system for simultaneous detection of matrix metalloproteinase-9 and 2 and its preparation and Application
【技术实现步骤摘要】
一种同时检测基质金属蛋白酶-9和2的系统及其制备方法和应用
本专利技术属于生物医学检测领域，具体涉及一种同时检测基质金属蛋白酶-9和2的系统及其制备方法和应用。
技术介绍
基质金属蛋白酶(MMPs)一大类需要锌的酶，包括间质胶原酶、基质蛋白酶、明胶酶等，它们协同降解细胞外基质中的各种蛋白成分，在各种病理生理过程(包括胚胎发育、炎症、伤口愈合和纤维化)以及组织重塑中起着重要作用。其中Ⅳ型胶原酶是其重要的一类，表现形式为基质金属蛋白酶-9(MMP-9)和基质金属蛋白酶-2(MMP-2)，具有降解IV型基底膜胶原的能力。在肾纤维化发展过程中，肾小管基底膜(TBM)完整性被破坏是导致上皮-间质转化(EMT)关键因素，而破坏TBM的两个最主要的蛋白酶便是MMP-9和MMP-2，这两个蛋白主要作用于IV型胶原蛋白，但恰好基底膜的最主要成分便是IV型胶原蛋白，在病理情况下，细胞会不断分泌产生MMP-9和MMP-2，从而导致TBM的破坏，进而促进肾纤维化发展进程。如果能够实现对MMP-9和MMP-2的检测，便一定程度上反映出TBM的完整性，从而可以实现对TBM的检测并加以干预，进一步实现药物预防和阻断EMT过程，从而可以有效的缓解整个肾纤维化进程。现有MMP-9或/和MMP-2蛋白含量和活性检测主要通过提取细胞蛋白，组织匀浆蛋白，应用蛋白免疫印迹、免疫染色、凝胶酶谱等方法测定，但这些方法普遍存在步骤繁冗、耗时较长、检测成本较高、需要经过长期训练的技术人员操作等不足。目前血清或者尿液中MMP-9或/和MMP-2含量测定主要还是依赖于ELISA试剂盒，极大地限制了MMP-9和MMP-2在临床上的检测。因此亟待发展一种能够实现更快速、特异、灵敏、简单的检测的新工具和新方法。
技术实现思路
专利技术目的：针对现有技术存在的问题，本专利技术提供一种同时检测基质金属蛋白酶-9和2的系统，该系统可以快速、简便、灵敏度高和选择性高的基于脱氧核糖核酸酶-I(DNase-I)同时检测基质金属蛋白酶-9(MMP-9)和基质金属蛋白酶-2(MMP-2)。本专利技术还提供了一种同时检测基质金属蛋白酶-9和2的系统的制备方法和应用。技术方案：为了实现上述目的，如本专利技术所述一种同时检测基质金属蛋白酶-9和2的系统，包括聚多巴胺纳米微球-修饰荧光素的核酸适配体纳米传感器(PDANS-aptamers)和脱氧核糖核酸酶；所述聚多巴胺纳米微球-修饰荧光素的核酸适配体纳米传感器由与修饰FAM荧光素的基质金属蛋白酶-9(MMP-9)特异性结合的适配体(MMP-9-aptamer-FAM)和修饰TexasRed荧光素的基质金属蛋白酶-2(MMP-2)特异性结合的适配体(MMP-2-aptamer-TexasRed)，加入到聚多巴胺纳米微球(PDANS)中形成。其中，所述修饰FAM荧光素的基质金属蛋白酶-9特异性结合的适配体，其核苷酸序列如SEQIDNO.1所示：5’-FAM-tacggccgcacgaaaaggtgccccataactcaatgccga-3’；所述修饰TexasRed荧光素的基质金属蛋白酶-2特异性结合的适配体，其核苷酸序列如SEQIDNO.2所示：5’-TexasRed-tcgccgtgtaggattaggccaggtatgggaacccggtaac-3’。其中，所述聚多巴胺纳米微球由盐酸多巴胺、Tris-HCl缓冲液、异丙醇和氨水合成。作为优选，主要包括100mg盐酸多巴胺、100mLTris-HCl缓冲液(10mMpH7.4)、40mL异丙醇和氨水，pH为8.0。本专利技术所述的同时检测基质金属蛋白酶-9和2的系统的制备方法，包括如下步骤：(1)将Tris-HCl缓冲液和异丙醇中加入氨水；搅拌使得溶液充分混匀；(2)取盐酸多巴胺溶于超纯水中，加入到上述(1)搅拌混匀的溶液中，避光继续搅拌；(3)将步骤(2)得到溶液离心弃去上清液，超纯水溶解沉淀，混匀，离心，弃去上清液，反复直至上清液澄清；(4)离心纯化后，沉淀即为聚多巴胺纳米微球(PDANS)，冷冻干燥成粉末备用；(5)构建与修饰FAM荧光素的基质金属蛋白酶-9(MMP-9-aptamer-FAM)特异性结合的适配体(aptamer)与修饰TexasRed荧光素的基质金属蛋白酶-2(MMP-2-aptamer-TexasRed)特异性结合的适配体(aptamer)，加入到聚多巴胺纳米微球溶液中，混匀，形成聚多巴胺纳米微球-修饰荧光素的核酸适配体(PDANS-aptamers)纳米传感器；(6)将基质金属蛋白酶-9(MMP-9)和基质金属蛋白酶-2(MMP-2)以及脱氧核糖核酸酶(DNase-I)加入到PDANS-aptamers纳米传感器中反应，MMP-9和MMP-2分别和aptamer特异性结合，aptamer从PDANS表面解离下来，DNase-I选择性水解aptamers，释放MMP-9和MMP-2，进行下一轮循环反应；(7)酶标仪读取荧光值，分别建立MMP-9和MMP-2浓度与荧光值的线性标曲得到同时检测基质金属蛋白酶-9和2的系统。其中，步骤(5)中所述聚多巴胺纳米微球(PDANS)溶液浓度为0.3-0.6mg/mL，MMP-9-aptamer-FAM和MMP-2-aptamer-TexasRed浓度分别为100-200nM。作为优选，步骤(5)中所述入聚多巴胺纳米微球(PDANS)溶液浓度为0.3mg/mL，MMP-9-aptamer-FAM和MMP-2-aptamer-TexasRed浓度分别为100nM构建纳米传感器。其中，步骤(6)中所述脱氧核糖核酸酶(DNase-I)浓度为5-20U，反应温度为37℃，反应时间为1-2h，反应缓冲液5-10mMCaCl2、2-5mMMgCl2。作为优选，步骤(6)中所述脱氧核糖核酸酶(DNase-I)浓度为10U，反应温度为37℃，反应时间为1h，反应缓冲液5mMCaCl2、2mMMgCl2。进一步地，步骤(7)利用酶标仪读取荧光信号，步骤(7)中所述MMP-9和MMP-2与荧光值的线性关系分别为：当MMP-9浓度在24～600pg/mL范围内符合线性方程Y＝0.0006X+0.3704，R2＝0.9904；当MMP-2浓度在64～1600pg/mL范围内符合线性方程Y＝0.0001X+0.5358，R2＝0.982，其中，Y为酶标仪读数，X为MMP-9或MMP-2浓度。本专利技术所述同时检测基质金属蛋白酶-9和2的系统在制备检测同时检测基质金属蛋白酶-9和2试剂或者工具中的应用。本专利技术方法的原理阐述如下：本专利技术基于荧光能量共振转移(FRET)效应构建了PDANS-aptamers纳米传感器，PDANS猝灭荧光素荧光，待测物(MMP-9和MMP-2)与其aptamer特异性结合后从PDNAS表面解离，荧光恢复。加入DNase-I，水解aptamer，待测物游离，循环反应，实现荧光信号放大，提高了检测体系的灵敏度本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种同时检测基质金属蛋白酶-9和2的系统，其特征在于，包括聚多巴胺纳米微球-修饰荧光素的核酸适配体纳米传感器和脱氧核糖核酸酶；所述聚多巴胺纳米微球-修饰荧光素的核酸适配体纳米传感器由修饰FAM荧光素的基质金属蛋白酶-9特异性结合的适配体和修饰Texas Red荧光素的基质金属蛋白酶-2特异性结合的适配体，加入到聚多巴胺纳米微球中形成。/n
【技术特征摘要】
1.一种同时检测基质金属蛋白酶-9和2的系统，其特征在于，包括聚多巴胺纳米微球-修饰荧光素的核酸适配体纳米传感器和脱氧核糖核酸酶；所述聚多巴胺纳米微球-修饰荧光素的核酸适配体纳米传感器由修饰FAM荧光素的基质金属蛋白酶-9特异性结合的适配体和修饰TexasRed荧光素的基质金属蛋白酶-2特异性结合的适配体，加入到聚多巴胺纳米微球中形成。
2.根据权利要求1所述的同时检测基质金属蛋白酶-9和2的系统，其特征在于，所述修饰FAM荧光素的基质金属蛋白酶-9特异性结合的适配体，其核苷酸序列如SEQIDNO.1所示：5’-FAM-tacggccgcacgaaaaggtgccccataactcaatgccga-3’；所述修饰TexasRed荧光素的基质金属蛋白酶-2特异性结合的适配体，其核苷酸序列如SEQIDNO.2所示：5’-TexasRed-tcgccgtgtaggattaggccaggtatgggaacccggtaac-3’。
3.根据权利要求1所述的同时检测基质金属蛋白酶-9和2的系统，其特征在于，所述聚多巴胺纳米微球优选由盐酸多巴胺、Tris-HCl缓冲液、异丙醇和氨水合成。
4.一种权利要求1所述的同时检测基质金属蛋白酶-9和2的系统的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)将Tris-HCl缓冲液和异丙醇中加入氨水；搅拌使得溶液充分混匀；
(2)取盐酸多巴胺溶于超纯水中，加入到上述(1)搅拌混匀的溶液中，避光继续搅拌；
(3)将步骤(2)得到溶液离心弃去上清液，超纯水溶解沉淀，混匀，离心，弃去上清液，反复直至上清液澄清；
(4)离心纯化后，沉淀即为聚多巴胺纳米微球(PDANS)，冷冻干燥成粉末备用；
(5)修饰FAM荧光素的基质金属蛋白酶-9(MMP-9-aptamer-FAM)特异性结合的适配体(aptamer)和修饰TexasRed荧光素的基质金属蛋白酶-2(MMP-2-aptamer-TexasRed)特异性结合的适配体(aptam...
【专利技术属性】
技术研发人员：田蒋为，余伯阳，胡依婷，
申请(专利权)人：中国药科大学，
类型：发明
国别省市：江苏;32
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