【技术实现步骤摘要】
GPBB胶乳增强比浊法检测试剂盒及其制备使用方法
本专利技术涉及基因工程技术及免疫学测定分析领域，具体涉及一种GPBB胶乳增强比浊法检测试剂盒及其制备使用方法。
技术介绍
糖原磷酸化酶(Glycogenphosphorylase，GP)是糖原分解代谢的关键酶。GP单体分子量约为94KD，常以同源二聚体形式存在。在人类组织中至少有三种类型的GP同工酶，根据其组织来源分别被命名为GPBB(脑型)、GPMM(肌型)和GPLL(肝型)。GPBB为胎儿时期的主要同工酶，成年后则主要在脑和心脏表达，两器官间表达量相近。GPBB作为糖原分解的关键酶，是心肌细胞中肌浆网结构(SR)中糖原分解复合物的特定成分，而这种复合物的结合和分解取决于心肌的氧及血液供给状态。正常条件下，糖原磷酸化酶复合物与SR牢固结合，不易分解。但当心肌细胞缺血、缺氧时，这种糖原分解的关键酶GPBB即可加速其分解过程。糖原降解过程可被磷酸化活性的GP(GPa)和非磷酸化活性的GP(GPb)以及AMP依赖形式所共同催化。缺血发生后，有利于结合型GPb向GPa转化，从而加速...
【技术保护点】
1.一种GPBB胶乳增强比浊法检测试剂盒，其特征在于，包括彼此独立的R1和R2双液体组分，包括的成分及相应含量为：/nR1：/n
【技术特征摘要】
1.一种GPBB胶乳增强比浊法检测试剂盒，其特征在于，包括彼此独立的R1和R2双液体组分，包括的成分及相应含量为：
R1：
R2：
2.根据权利要求1所述的GPBB胶乳增强比浊法检测试剂盒，其特征在于，包括的成分及相应含量为：
R1：
R2：
3.根据权利要求1所述的GPBB胶乳增强比浊法检测试剂盒，其特征在于，还包括GPBB校准品，包括的成分及相应含量为：
4.根据权利要求3所述的GPBB胶乳增强比浊法检测试剂盒，其特征在于，所述GPBB校准品包括的成分及相应含量具体为：
5.根据权利要求3所述的GPBB胶乳增强比浊法检测试剂盒，其特征在于，所述GPBB校准品中rGPBB具体为重组人GPBB蛋白，获取方法具体如下：
①人GPBB基因的获取：
参考GENBANK登录号NM_002862.4，上游添加酶切位点SnaBI，并添加柔性linker以保护目的片段的空间结构，下游添加酶切位点NotI和保护碱基，获得如SEQIDNO.1所示基因序列；得到基因序列后，送基因公司合成，测序合格，获得目标基因序列；
②表达载体构建：
使用SnaBI和NotI两种内切酶对合成的基因及pPIC9K质粒进行双酶切，将双酶切产物使用连接酶连接，并电转导入毕赤酵母感受态细胞中，涂布于含100mg/LZeocin的YPD平板上，28℃恒温培养36h，挑取抗性平板上生长的菌落送往基因测序鉴定目的基因，符合度99.99％，鉴定为阳性，表示表达载体构建成功，记为GS15/rGPBB工程菌；
③重组人GPBB的表达和纯化：
取经测序GPBB阳性菌于BMGY培养基中摇床培养，培养条件为28℃、250r/min，培养至OD600为2～6时，离心收集菌体；用BMMY培养基重悬菌体，至OD600为1，继续摇床发酵，并且，每24h向培养基中添加无水甲醇至终浓度为1％；培养48h终止，于12000rpm/min转速下离心5min，取上清，即得目的蛋白rGPBB粗制品；
将上述目的蛋白rGPBB粗制品加入肠激酶，并于23℃水浴下酶切过夜；酶切后，将粗制蛋白过滤处理，过GST亲和层析柱，并用第一Elutionbuffer梯度洗脱，收集rGPBB峰；过脱盐柱，用脱盐柱缓冲液置换，再分别用Loadingbuffer平衡好柱体，上样后用第二Elutionbuffer梯度洗脱，收集rGPBB峰；将获得的rGPBB过分子筛层析柱，用第三Elutionbuffer收集rGPBB峰；其中，所述第一Elutionbuffer的配方为：50mMTris-Cl，40mM还原性谷胱甘肽，pH7.0；所述脱盐柱缓冲液的配方为：50mMTris-Cl，pH9.0；所述Loadingbuffer的配方为：50mMTris-Cl，pH7.0；所述第二Elutionbuffer的配方为：50mMTris-Cl，1MNaCl，pH7.0；所述第三Elutionbuffer的配方为：50mMNa2HPO4，0.15MNaCl，pH7.0；
使用GPBB抗体为第一抗体，使用HRP标记的山羊抗兔IgG为第二抗体做WB，当收集的上述rGPBB蛋白样本在110kD处有阳性条带，即表明纯化后所得rGPBB为目标所需的重组人GPBB蛋白；此时，加入终浓度20％甘油无菌分装，于-80℃保存备用。
6.根据权利要求1-5任一所述的GPBB胶乳增强比浊法检测试剂盒，其特征在于，所述偶联山羊抗人GPBB多克隆抗体的胶乳微球的获取方法为：使用直径为30～60nm的聚苯乙烯胶乳微球，并采用共价偶联法将山羊抗人GPBB多克隆抗体偶联到聚苯乙烯胶乳微球上。
7.根据权利要求6所述的GPBB胶乳增强比浊法检测试剂盒，其特征在于，所述山羊抗人GPBB多克隆抗体的制备方法为：
(1)重组人GPBB蛋白的制备
①人GPBB基因的获取：
参考GENBANK登录号NM_002862.4，上游添加酶切位点SnaBI，并添加柔性linker以保护目的片段的空间结构，下游添加酶切位点NotI和保护碱基，获得如SEQIDNO.1所示基因序列；得到基因序列后，送基因公司合成，测序合格，获得目标基因序列；
②表达载体构建：
使用SnaBI和NotI两种内切酶对合成的基因及pPIC9K质粒进行双酶切，将双酶切产物使用连接酶连接，并电转导入毕赤酵母感受态细胞中，涂布于含100mg/LZeocin的YPD平板上，28℃恒温培养36h，挑取抗性平板上生长的菌落送往基因测序鉴定目的基因，符合度99.99％，鉴定为阳性，表示表达载体构建成功，记为GS15/rGPBB工程菌；
③重组人GPBB的表达和纯化：
取经测序GPBB阳性菌于BMGY培养基中摇床培养，培养条件为28℃、250r/min，培养至OD600为2～6时，离心收集菌体；用BMMY培养基重悬菌体，至OD600为1，继续摇床发酵，并且，每24h向培养基中添加无水甲醇至终浓度为1％；培养48h终止，于12000rpm/min转速下离心5min，取上清，即得目的蛋白rGPBB粗制品；
将上述目的蛋白rGPBB粗制品加入肠激酶，并于23℃水浴下酶切过夜；酶切后，将粗制蛋白过滤处理，过GST亲和层析柱，并用第一Elutionbuffer梯度洗脱，收集rGPBB峰；过脱盐柱，用脱盐柱缓冲液置换，再分别用Loadingbuffer平衡好柱体，上样后用第二Elutionbuffer梯度洗脱，收集rGPBB峰；将获得的rGPBB过分子筛层析柱，用第三Elutionbuffer收集rGPBB峰；其中，所述第一Elutionbuffer的配方为：50mMTris-Cl，40mM还原性谷胱甘肽，pH7.0；所述脱盐柱缓冲液的配方为：50mMTris-Cl，pH9.0；所述Loadingbuffer的配方为：50mMTris-Cl，pH7.0；所述第二Elutionbuffer的配方为：50mMTris-Cl，1MNaCl，pH7.0；所述第三Elutionbuffer的配方为：50mMNa2HPO4，0.15MNaCl，pH7.0；
使用GPBB抗体为第一抗体，使用HRP标记的山羊抗兔IgG为第二抗体做WB，当收集的上述rGPBB蛋白样本在110kD处有阳性条带，即表明纯化后所得rGPBB为目标所需的重组人GPBB蛋白；此时，加入终浓度20％甘油无菌分装，于-80℃保存备用；
(2)山羊抗人GPBB多克隆抗体的获得
①山羊的免疫：
选择7月龄、体重40～50kg的雌性山羊；取1mL5mg/mLrGPBB，使用弗氏完全佐剂乳化，每只山羊于四蹄注射共2mL乳化rGPBB，进行第一次免疫；7日后，使用弗氏完全佐剂乳化的rGPBB进行第二次免疫，免疫方案如前；21日后，使用弗氏不完全佐剂乳化的rGPBB进行第三次免疫，免疫方案如前；42日后，使用弗氏不完全佐剂乳化的rGPBB进行第四次免疫，免疫方案如前；49日后，进行第五次免疫，采用耳缘静脉注射2mL2.5mg/mLrGPBB；55日，取耳缘静脉血，并使用琼脂双扩散法测抗体效价，测得效价1:32及以上，终止免疫；采用颈部静脉无菌放血法获得全血；
②多克隆抗体的纯化：
将上述步骤获得的全血于室温划十字...
【专利技术属性】
技术研发人员：芮双印，符修乐，
申请(专利权)人：安徽大千生物工程有限公司，
类型：发明
国别省市：安徽;34
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