一种胶乳定向偶联技术检测脂蛋白（a）的方法技术

本发明专利技术提供一种胶乳定向偶联技术检测脂蛋白(a)的方法，所述检测方法原理基于胶乳增强免疫比浊法，其特点在于利用抗体定向偶联技术，通过N‑羟基琥珀酰亚胺/马来酰亚胺异双功能交联剂分别活化两种粒径的氨基聚苯乙烯胶乳微球，还原法还原抗人脂蛋白(a)单克隆抗体，使活化后的两种粒径的胶乳微球分别与还原后的抗脂蛋白(a)单克隆抗体定向偶联，形成抗人脂蛋白(a)胶乳颗粒，使抗体以Fc区连接微球，Fab区向外伸展，实现与样本抗原高效结合，在37℃恒温，波长为600nm下，测定吸光度，计算出样品脂蛋白(a)含量。与传统方法相比，本检测方法抗体利用率高，灵敏度高，线性好，能有效控制批间差，值得进一步推广使用。

【技术实现步骤摘要】

：本专利技术涉及医学检测及体外诊断领域，具体涉及一种胶乳定向偶联技术检测脂蛋白(a)的方法。
技术介绍
：脂蛋白(a)是一种特殊独立的血浆脂蛋白，类似低密度脂蛋白(LDL)的脂质，是1963年挪威遗传学家Berg在研究低密度脂蛋白的遗传学变异时发现的，主要在肝脏合成后分泌入血，其含量的变化在血栓性疾病，肾脏疾病，糖尿病等疾病中具有非常重要的临床意义。目前市场上脂蛋白(a)检测技术常用的方法有如下几种：单向免疫扩散(SRID)、放射免疫测定法(RIA)、荧光免疫测定发(FIA)、时间分辨荧光免疫测定法(TRFIA)、酶联免疫测定法(ELISA)、胶乳颗粒法、颗粒增强透射、免疫比浊法(PETIA)、颗粒增强散射免疫比浊法(PENIA)、胶乳增强免疫透射比浊法等，以胶乳增强免疫比浊法居多。胶乳增强免疫比浊法属于普通免疫比浊技术的衍生技术，克服了普通免疫比浊技术信号量非常有限的缺点，使抗体体积有了数量级上的增长，大幅提升了可检测性，成为一种简便快速，灵敏度高的检测方法，但该方法也存在巨大的技术难点，即抗体连接到胶乳微球上的方向无法控制，使得其活性及稳定性(包括不随时间的改变而发生变化及批间一致性)不能保证。因此，找到一种抗体与胶乳微球间定向偶联的方法，将两者连接的方向可控，是本领域亟需解决的技术问题。
技术实现思路
：鉴于以上技术问题，本专利技术的目的在于提出一种胶乳定向偶联技术检测脂蛋白(a)的方法，以胶乳增强免疫比浊法为基础，运用抗体定向偶联技术，通过N-羟基琥珀酰亚胺/马来酰亚胺异双功能交联剂分别活化两种粒径的氨基聚苯乙烯胶乳微球，还原法还原抗人脂蛋白(a)单克隆抗体，使活化后的两种粒径的胶乳微球分别与还原后的抗人脂蛋白(a)单克隆抗体定向偶联，形成抗人脂蛋白(a)胶乳颗粒，使抗体以Fc区连接微球，Fab区向外伸展，实现与样本抗原高效结合。本专利技术的技术方案为：以N-羟基琥珀酰亚胺/马来酰亚胺异双功能交联剂作为两种粒径的氨基聚苯乙烯胶乳微球的活化剂，形成活化态胶乳微球；还原法还原抗人脂蛋白(a)单克隆抗体，使抗体二硫键打开形成游离巯基，与活化态胶乳微球进行偶联，形成稳定的硫醚键，从而实现定向偶联。以此方法为基础制备检测试剂盒，试剂1包括缓冲液、稳定剂和防腐剂，试剂2包括抗人脂蛋白(a)胶乳微球、缓冲液、保护剂、稳定剂和防腐剂。本专利技术上述试剂盒中所述试剂1与试剂2中的缓冲液包括但不限于Tris-HCL缓冲液，PBS缓冲液，磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液，磷酸二氢钾-氢氧化钠缓冲液中的一种或几种，更优选PBS缓冲液。PH范围为6.5-8.5，更优选PH6.5-7.5。本专利技术所述试剂1中的稳定剂包括但不限于聚乙二醇8000，蔗糖，甘油，葡萄糖，明胶，氯化钠，氯化钾，碳酸钠，硫酸钠，硫酸钾中的一种或几种，更优选聚乙二醇8000。本专利技术所述试剂1中与试剂2中的防腐剂包括但不限于叠氮钠，proclin300，硫柳汞中的一种或几种。本专利技术上述试剂盒中所述试剂2中的保护剂为EDTA。本专利技术所述试剂2中的稳定剂包括但不限于聚乙二醇8000，蔗糖，甘油，葡萄糖，明胶，氯化钠，氯化钾，碳酸钠，硫酸钠，硫酸钾中的一种或几种，更优选蔗糖。进一步地，以上述优选材料配制试剂盒(液体双试剂，R1∶R2为4∶1)，浓度分别为试剂R1：PBS缓冲液(PH7.0)20～100mmol/L聚乙二醇8000(PEG8000)10～30g/L叠氮钠0.05％本专利技术所述试剂2中的抗人脂蛋白(a)胶乳微球具体制备如下：1)氨基聚苯乙烯胶乳微球的活化分别取浓度均为2.5％(w/v)的两种粒径的氨基聚苯乙烯胶乳微球与N-羟基琥珀酰亚胺/马来酰亚胺异双功能交联剂，按投料比为1∶5(重量比)混合于PBS缓冲液(20mmol/L，PH7.0)中，25℃活化30-60min，高速离心(10000rpm，30min)，去除上清液，用PBS缓冲液(20mmol/L，PH7.0)洗涤两次去除多余交联剂，洗涤后用PBS缓冲液(20mmol/L，PH7.0)配成1％(w/v)混合液，25℃震荡10-20min重悬，获得活化胶乳微球。所述的氨基聚苯乙烯胶乳微球粒径分别选择100-200nm，200-300nm两种规格，更优选粒径分别为110nm和200nm。颗粒比例为20∶80-80∶20，更优选60∶40。所述的N-羟基琥珀酰亚胺/马来酰亚胺异双功能交联剂包括但不限于4-(N-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧酸磺酸基琥珀酰亚胺酯钠盐(Sulfo-SMCC)，4-(N-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧酸磺酸基琥珀酰亚胺酯(SMCC)，硫代琥珀酰亚胺基4-(p-马来酰亚胺苯基)丁酯(Sulfo-SMPB)，琥珀酰亚胺基4-(p-马来酰亚胺苯基)丁酸盐(SMPB)，琥珀酰亚胺基-6-[(β-马来酰亚胺丙酰胺基)]己酯(SMPH)，m-马来酰亚胺苯甲酰-N-羟基硫代琥珀酰亚胺酯(Sulfo-MBS)，N-[κ-马来酰亚胺十一酰氧]-硫代琥珀酰亚胺酯(Sulfo-KMUS)，N-(γ-马来酰亚胺丁酰氧]琥珀酰亚胺酯(Sulfo-GMBS)，N-[ε-马来酰亚胺乙酰基氧]硫代琥珀酰亚胺酯(Sulfo-EMCS)中的一种或几种，更优选4-(N-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧酸磺酸基琥珀酰亚胺酯钠盐(Sulfo-SMCC)。2)抗人脂蛋白(a)单克隆抗体还原取抗人脂蛋白(a)单克隆抗体与还原剂(1-10mM)，按投料比为1∶800(重量比)混合于PBS缓冲液(20mmol/L，PH7.0)中，25℃还原30min，通过superdex200层析分离去除多余还原剂，加入碘乙酰胺0.5mg，37℃封闭巯基30-45min。所述为鼠抗人脂蛋白(a)单克隆抗体或羊抗人脂蛋白(a)单克隆抗体中的任意一种。所述的还原剂包括但不限于二硫苏糖醇(DTT)，β-巯基乙醇(ME)，三(2-羧乙基)膦(TCEP)中的一种或几种，更优选三(2-羧乙基)膦(TCEP)。3)活化胶乳微球与还原后的抗体于PBS缓冲液(20mmol/L，PH7.0)中，25℃定向偶联60min，巯基乙醇(10mmol/L)淬灭30min后，高速离心(10000rpm，30min)，去除上清液，用PBS缓冲液(20mmol/L，PH7.0)洗涤三次，用PBS缓冲液(20mmol/L，PH7.0)配成1％(w/v)混合液，25℃震荡30min重悬，获得抗人脂蛋白(a)胶乳颗粒。本专利技术的检测方法为胶乳增强免疫比浊法，测试条件及参数如下：1)检测仪器：具有600nm波长、37℃恒温装置的生化分析仪。2)待测样本：新鲜不溶血血清，可2-8℃保存。3)具体检测程序：4)校准程序：多点定标，采用非线性校准模式。5)计算结果：以测定管ΔA，根据校准曲线可求得脂蛋白(a)含量。本专利技术的优势在于：利用两种不同粒径聚苯乙烯胶乳微球，在提升灵敏度的同时，具有较好的线性，提高了产品性能。利用定向偶联方法使抗体连接方向可控，提高了抗体利用率，并实现与样本抗原高效结合。降低抗体偶联的随机性后，大大降低了对批间差异控制的难度。本方法可以通用于各种不同抗体或蛋白质与胶乳微球偶联，易于形成规模化的工艺。附图说明：图1为实施例1中的本专利技术线性相关本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种胶乳定向偶联技术检测脂蛋白(a)的方法，以胶乳增强免疫比浊法为基础，运用抗体定向偶联技术，通过N‑羟基琥珀酰亚胺/马来酰亚胺异双功能交联剂分别活化两种粒径的氨基聚苯乙烯胶乳微球，还原法还原抗人脂蛋白(a)单克隆抗体，使活化后的两种粒径的胶乳微球分别与还原后的抗人脂蛋白(a)单克隆抗体定向偶联，形成抗人脂蛋白(a)胶乳颗粒。

【技术特征摘要】
1.一种胶乳定向偶联技术检测脂蛋白(a)的方法，以胶乳增强免疫比浊法为基础，运用抗体定向偶联技术，通过N-羟基琥珀酰亚胺/马来酰亚胺异双功能交联剂分别活化两种粒径的氨基聚苯乙烯胶乳微球，还原法还原抗人脂蛋白(a)单克隆抗体，使活化后的两种粒径的胶乳微球分别与还原后的抗人脂蛋白(a)单克隆抗体定向偶联，形成抗人脂蛋白(a)胶乳颗粒。2.根据权利要求1所述的抗体定向偶联技术，其特征在于以N-羟基琥珀酰亚胺/马来酰亚胺异双功能交联剂作为两种粒径的氨基聚苯乙烯胶乳微球的活化剂，形成活化态胶乳微球；还原法还原抗人脂蛋白(a)单克隆抗体，使抗体二硫键打开形成游离巯基，与活化态胶乳微球进行偶联，形成稳定的硫醚键，从而实现定向偶联。3.根据权利要求1所述的N-羟基琥珀酰亚胺/马来酰亚胺异双功能交联剂，其特征在于包括但不限于4-(N-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧酸磺酸基琥珀酰亚胺酯钠盐(Sulfo-SMCC)，4-(N-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧酸磺酸基琥珀酰亚胺酯(SMCC)，硫代琥珀酰亚胺基4-(p-马来酰亚胺苯基)丁酯(Sulfo-SMPB)，琥珀酰亚胺基4-(p-马来酰亚胺苯基)丁酸盐(SMPB)，琥珀酰亚胺基-6-[(β-马来酰亚胺丙酰胺基)]己酯(SMPH)，m-马来酰亚胺苯甲酰-N-羟基硫代琥珀酰亚胺酯(Sulfo-MBS)，N-[κ-马来酰亚胺十一酰氧]-硫代琥珀酰亚胺酯(Sulfo-KMUS)，N-[γ-马来酰亚胺丁酰氧]琥珀酰亚胺酯(Sulfo-GMBS)，N-[ε-马来酰亚胺乙酰基氧]硫代琥珀酰亚胺酯(Sulfo-EMCS)中的一种或几种，更优选4-(N-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧酸磺酸基琥珀酰亚胺酯钠盐(Sulfo-SMCC)。4.根据权利要求1所述的两种粒径的氨基聚苯乙烯胶乳微球，其特征在于粒径分别选择100-200nm，200-300nm两种规格，更优选粒径分别为110nm和200nm。颗粒比例为20∶80-80∶20，更优选60∶40。5.抗人脂蛋白(a)胶乳微球具体制备如下：1...

【专利技术属性】
技术研发人员：王贤俊，郑蓓蕾，
申请(专利权)人：王贤俊，
类型：发明
国别省市：浙江;33