本发明专利技术涉及一种骆驼蓬脂转移蛋白基因(PhLTP)，以及制备获得重组骆驼蓬脂转移蛋白的方法及其在抑菌和抗肿瘤方面的应用。所述的骆驼蓬脂转移蛋白基因具有序列表SEQ?ID?NO.1中所示的碱基序列，其编码由序列表SEQ?ID?NO.2中所示的氨基酸序列中由115个氨基酸组成的蛋白质。本发明专利技术经基因克隆，构建高表达质粒，获得重组菌，并利用此工程菌表达和分离纯化生产出具有生物活性的重组骆驼蓬脂转移蛋白。本系统具有可溶性表达水平高、纯化工艺简单、产品纯度高的特点。本发明专利技术通过实验验证了其生物学功能，证实该重组蛋白具有明显的抑菌作用，对多种恶性肿瘤具有较强的肿瘤细胞杀伤作用，可在制备抗微生物感染和治疗肿瘤的药物中应用。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于基因工程领域，涉及一种来自骆驼蓬中的脂转移蛋白基因WiLTP，以及制备获得重组骆驼蓬脂转移蛋白的方法及其在抑菌和抗肿瘤方面的应用。
技术介绍
植物体在受到病原菌的侵害时，首先产生的防御机制便是抗菌蛋白，其作用范围较广，包括革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌、霉菌、原虫、寄生虫及含有外套膜的病毒，而且也有研究报告指出抗菌蛋白能够抑制肿瘤细胞的生长。抗菌蛋白广泛存在于自然界许多生物体中，是一道天然的防御系统，其中，病程相关蛋白(pathogenesis-related proteins, PRs)、防御素(defensins)、核糖体失活蛋白(ribosome. inactivating proteins,RIPs)和脂转移蛋白(lipid transfer protein, LTP)等都起着非常重要的作用。脂转移蛋白是一类分子量相对较小的碱性蛋白质，在植物、动物、酵母、真菌和一些细菌中均有发现。在动物中有特异脂转移蛋白(lipid transfer proteins, LTPs)和非特异性脂转移蛋白(non-specific lipid transfer protein，nsLTP)，在植物中因其脂转移活性具有广泛性和不确定性，植物中至今只发现有nsLTP。植物中nsLTP能够转移磷脂酰肌醇、磷脂酰胆碱和磷脂酰丝氨酸，并能够促进微体和线粒体之间的磷脂交换。现在已从多种植物中分离得到nsLIPs，如玉米、水稻、大麦、谷子、洋葱、豇豆、白菜、菠菜、甜桔、萝卜、桃和拟南芥等。在植物中非特异脂转移蛋白都是可溶性蛋白，可以达到可溶蛋白总量的4%。 由于植物nsLIPs具有很强的抗真菌和细菌的活性，所以被列为植物防御蛋白系列。然而目前一些研究还发现植物nsLTPs还具有较强的抗肿瘤活性。近年来，从传统中草药中继续挖掘具有应用价值的蛋白质或多肽，已经成为一个重要的研究热点。骆驼蓬(Peganum harmala L.)是蒺藜科(Zygophyllaceae)骆驼蓬属(Peganum) 多年生药用草本植物，已列入维吾尔药卫生部药品标准。多分布于干旱草地、盐碱化荒漠地带。骆驼蓬富含多种生物碱，具有抗癌、消炎、抗病毒等多种药理及杀虫抑菌活性，这些生物活性引起了人们对野生骆驼蓬资源的关注。本专利技术首次从骆驼蓬幼叶中克隆出脂转移蛋白基因并构建表达载体进行重组表达，该重组表达蛋白具有抑菌和抗肿瘤活性的作用，未见现有文献报道。本专利技术为科学认识骆驼蓬中活性蛋白的功能提供依据，对脂转移蛋白以及其他类型抗菌蛋白的研究不仅具有重要的理论意义，在抗微生物感染和抗肿瘤药物的治疗方面也具有广泛的应用价值。
技术实现思路
本专利技术涉及一种骆驼蓬脂转移蛋白基因，并提供重组骆驼蓬脂转移蛋白WiLTP在大肠杆菌中高效表达的方法，证明该重组表达蛋白的用途，以扩大药用植物骆驼蓬的应用范围。本专利技术所述骆驼蓬脂转移蛋白基因，具有序列表SEQ ID NO. 1中所示的碱基序列， 全长为348bp，其编码一种骆驼蓬脂转移蛋白，具有序列表SEQ ID N0. 2中所示的由115个氨基酸组成的氨基酸序列，其中含有8个半胱氨酸残基，分别在序列表SEQ ID NO. 2中所示的氨基酸序列中第29、39、54、55、75、77、100和114的位置上。本专利技术提供了一种骆驼蓬脂转移蛋白基因在大肠杆菌中高效重组表达的方法和应用，包括如下步骤(1)骆驼蓬总RNA的提取和反转录合成cDNA 将骆驼蓬种子萌发6天后，取幼叶放入无RNA酶的研钵中液氮研磨，使用Trizol试剂提取总RNA ；用琼脂糖凝胶电泳和紫外分光光度法检测其总RNA质量，A260/280约2. O为纯度较好；以总RNA为模板，Oligo dT为引物，使用反转录酶M-MLV (RNase H-)，合成cDNA ；O) PCR扩增骆驼蓬脂转移蛋白基因(PhLTP)根据登录在国际检索数据库NCBI上的其他植物脂转移蛋白的cDNA序列，设计并合成一对简并引物，以步骤⑴合成的cDNA为模板，经聚合酶链式反应(PCR)扩增出348bp的DNA片段，回收PCR产物并纯化后，克隆到T 载体pCR2. 1上，对阳性转化子进行菌落PCR检测，酶切鉴定重组质粒插入片段的大小正确后，进行测序分析，鉴定获得正确的骆驼蓬脂转移蛋白基因WiLTP ；(3)构建重组质粒pET30a_PhLTP及相应的重组基因工程菌设计特异性引物用于扩增获得WiLTP基因核酸序列，经双酶切将WiLTP亚克隆至经同样双酶切的pET30a载体中，构建重组表达质粒pET30a-PhLTP ；转化到大肠杆菌Ε. coli BL21(DE3)中获得基因工程菌，简称 E. coli BL21/pET30a-PhLTP ；(4)重组质粒pET30a_PhLTP的高效表达及纯化以LB为基础培养基，将基因工程菌E. coli BL21/pET-30a-PhLTP经过IPTG诱导培养获得可溶性的重组表达蛋白，其中培养温度是观°0，pH 7.0;离心收集菌体，采用超声波破碎法裂解细胞，离心获得上清可溶性蛋白，通过金属镍螯合柱层析方法纯化，获得纯度达97%以上的重组骆驼蓬脂转移蛋白，经 SDS-PAGE电泳检测证明得到了可溶性、高效表达的重组骆驼蓬脂转移蛋白WiLTP。(5)重组骆驼蓬脂转移蛋白的功能活性和应用上述步骤(4)得到的纯化的重组骆驼蓬脂转移蛋白WiLTP具有抑菌和抑制肿瘤活性，在病原微生物感染和在肿瘤的药物治疗方面具有良好的应用前景。本专利技术得到的一种重组表达的骆驼蓬脂转移蛋白PhLTP具有明显的抑菌活性，对三种病原细菌，如肺炎克雷伯氏菌(klesiella peneumoniae)，大肠埃希菌(Escherichia coliAtc25922)，类产碱假单胞菌(Pseudomonas pseudoalcaligenes)均具有抑制效果，且随样品浓度升高抑制效果增强。当重组蛋白浓度在0. 3mg/mL时，对三种菌的抑菌圈直径范围在16. 0-18. Omm，所述重组蛋白可以用于制备抗微生物感染药物制剂。本专利技术所得到的重组骆驼蓬脂转移蛋白还具有明显的抗癌活性，在体外对多种肿瘤细胞均具有高抑制作用，但对正常细胞毒性较小。实验证实，使用MTT法测定重组脂转移蛋白对常见癌细胞如人宫颈癌细胞HeLa、食管癌细胞Eca-109和鼠黑色素瘤细胞B16具有显著的抑制生长作用，其中对B16细胞抑制作用较强，作用24h时对黑色素瘤细胞的半数抑制浓度(IC5tl)仅为12. 5 μ g/mL，而对正常细胞Vero抑制作用较弱。这些实验表明重组骆驼蓬脂转移蛋白PhLTP在抗病原细菌感染的生物制剂及在肿瘤疾病的药物治疗方面具有良好的应用前景。关于重组骆驼蓬脂转移蛋白WiLTP的制备和活性等未见报道。本专利技术进一步详细提供了骆驼蓬脂转移蛋白基因WiLTP在大肠杆菌中高效表达的方法，具体步骤如下(1)骆驼蓬总RNA的提取和反转录合成cDNA将骆驼蓬种子萌发6天后，称取0. Ig骆驼蓬叶片放入无RNA酶的研钵中液氮研磨成粉末，将粉末倒入含有Iml Trizol的EP管中，剧烈振荡以裂解细胞，加0. 2ml氯仿，震荡 I5秒，在室温下(15°C 30°C )放置2 ;3min后，l2000g(2°C 8本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：孙素荣，张富春，刘东亮，吕慧，李婷婷，
申请(专利权)人：新疆大学，
类型：发明
国别省市：
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