＊＊＊ 本发明专利技术涉及基因治疗方法，该方法能够提供编码载脂蛋白Ａ－Ⅰ（ＡｐｏＡ－Ⅰ）天然形式之改良形式的核苷酸序列：成熟ＡｐｏＡ－Ⅰ、前ＡｐｏＡ－Ⅰ原和ＡｐｏＡ－Ⅰ原；其中经过改良的天然ＡｐｏＡ－Ⅰ包括ＡｐｏＡ－Ⅰ激动剂，即能模拟天然ＡｐｏＡ－Ⅰ活性的肽，和超激动剂，即活性超过天然ＡｐｏＡ－Ⅰ的肽并且修饰的天然ＡｐｏＡ－Ⅰ含有一或多个由一或多个ＡｐｏＡ－Ⅰ激动剂的核苷酸序列所替代的两导性螺旋；该基因疗法可以用于治疗异常脂蛋白血相关疾病，包括心血管疾病、动脉硬化症、再狭窄症、高血脂病以及其它其他疾病，例如脓毒性休克。（*该技术在2018年保护过期，可自由使用*）
【技术实现步骤摘要】
1．简介本专利技术涉及基因治疗方法，该方法能够提供编码载脂蛋白A-Ⅰ(ApoA-Ⅰ)天然形式之改良形式的核苷酸序列，即成熟ApoA-Ⅰ、前ApoA-Ⅰ原和ApoA-Ⅰ原；ApoA-Ⅰ肽；ApoA-Ⅰ激动剂和超激动剂，即能够模拟或超过天然ApoA-Ⅰ的活性的肽；以及用于治疗异常脂蛋白血相关疾病的天然ApoA-Ⅰ基因，所述疾病包括心血管疾病、动脉硬化症、心瓣手术后的再狭窄症、高血脂病以及其它其他疾病，例如脓毒性休克。2．专利技术背景循环系统胆固醇携带者为血浆脂蛋白——能够转运血脂的由复合脂类和蛋白质形成的复合物颗粒。低密度脂蛋白(LDL)和高密度脂蛋白(HDL)是主要的胆固醇携带者。低密度脂蛋白负责把肝中的胆固醇(其中胆固醇是从饮食中合成或得到的)输送到体内的肝外组织。术语“逆向胆固醇转运”是指把肝外组织的胆固醇转运到肝中的过程，胆固醇在肝中代谢并排泄。血浆HDL颗粒在逆向转运过程中起着重要的作用，扮演着组织胆固醇清洁工的角色。大量的证据表明升高的血清脂蛋白与冠心病有关。例如，动脉粥样硬化是以在动脉壁上积聚胆固醇的慢性进行性过程。明显的证据支持如下事实储存在动脉粥样硬化病变处的脂类主要由从血浆LDL输送而来；因此，LDLs又被通俗地称为“坏”胆固醇。相反，HDL血清水平与冠心病负相关——实际上，高血清水平的HDL被认为是负危险度。认为高水平血浆脂蛋白不仅可以预防冠心病，而且确实可以导致动脉粥样硬化斑的衰退(例如，Badimon et al.,1992,Circulation 86(Suppl.Ⅲ):86-94)。因此，普遍地又将HDL称为“好”胆固醇。2.1.胆固醇的转运脂肪转运系统可以分为两种途径一种为用于肠道吸收的胆固醇和甘油三酯的外源性途径，一种为用于从肝及其他非-肝组织进入血流的胆固醇和甘油三酯的内源性途径。外源性途径中，饭食中的脂肪被包装成称为乳糜微粒的脂蛋白颗粒，乳糜微粒进入血流并将它们中的甘油三酯运输到脂肪组织(用于存储)和肌肉(用于氧化提供能量)。含有胆固醇酯的乳糜微粒剩余物被一种特殊受体从循环系统中清除，该受体只发现于肝细胞。然后，这种胆固醇又可以为细胞代谢所利用或者作为血浆脂蛋白再循环到肝外组织。内源性途径中，肝向血流中分泌大的、极低密度脂蛋白(VLDL)。VLDLs的核心主要由肝中合成的甘油三脂组成，另有较少量的胆固醇脂(肝内合成或从乳糜微粒再循环而来)。两种主要的蛋白质，载脂蛋白B-100和载脂蛋白E。当VLDL到达脂肪组织或肌肉的毛细血管时，其中的甘油三脂被提出从而形成一种称为中间密度脂蛋白(IDL)的新颗粒，这种新颗粒大小减小并富集胆固醇酯，但仍保留了其两种载脂蛋白。人体内，约一半的IDL颗粒被从循环系统中快速清除(它们合成的2～6小时内)，因为它们与肝细胞紧密结合，肝细胞提取出其中的胆固醇，生成新的VLDL和胆汁酸。未被肝细胞吸收的IDL颗粒则会在循环系统中保留更长的时间。此时，载脂蛋白E从循环颗粒中解离出来，使该颗粒转化为只有载脂蛋白B-100作为其唯一蛋白的LDL。首先，肝细胞吸收并降解大部分胆固醇生成胆汁酸，胆汁酸是胆固醇代谢的终产物。含颗粒胆固醇的吸收由LDL受体介导，该受体以高浓度存在于肝细胞上。LDL受体结合载脂蛋白E和载脂蛋白B-100，并负责从循环系统中结合和去除IDLs和LDLs。但是，载脂蛋白E与LDL受体的结合力比载脂蛋白B-100大。因此，LDL颗粒具有比IDL颗粒大得多的半衰期范围——在结合肝和其他组织中LDL受体之前，LDL循环的时间段为2天半。高水平LDL(“坏”胆固醇)与冠心病正相关。例如，动脉硬化症中，来自循环LDLs的胆固醇积聚在动脉壁导致形成大块病变，这种大块病变抑制血流直到最终形成栓塞，阻塞动脉引发心肌梗塞或心绞痛。最后，从LDLs从释放出的胞内胆固醇的量控制细胞胆固醇代谢。来自VDLs和LDLs细胞胆固醇的积聚控制着3个途径第一，它可以通过关闭HMGCoA还原酶—胆固醇生物合成途径中的一种关键酶，减少细胞胆固醇的合成。第二，通过激活ACAT—能够把胆固醇转化成储存在存储小滴中的胆固醇酯的酶，新进入的LDL-衍生胆固醇促进胆固醇的存储。第三，细胞中胆固醇的积聚驱动一种反馈机制，抑制新LDL受体的细胞合成。因此，细胞可以调节其对LDL受体的补充，从而能有足够量胆固醇满足代谢需要，而不过量。(综述，见Brown & Goldstein,In,The Pharmacological Basis Of Therapeutics,8th Ed.,Goodman &Gilman,Pergamon Press,NY,1990,Ch.36,pp.874-896)。2.2.逆向胆固醇转运总之，外周(非肝)细胞从原位合成以及吸收来自VLDLs和LDLs的预成固醇的结合，获得它们的胆固醇。反之，逆向胆固醇转运(RCT)是这样一种途径，即能够将外周细胞胆固醇返回到肝细胞，用于再循环到肝外组织，或者以胆汁排泄到肠道，经修饰或氧化形成胆汁酸。RCT途径是从大部分肝外组织中清除胆固醇的唯一方法，对维持体内多数细胞的结构和功能起着关键作用。RCT主要包括3个步骤(a)胆固醇的流出，最初从外周细胞的各种库中移取胆固醇；(b)卵磷脂胆固醇脂酰基转移酶(LCAT)作用下的胆固醇酯化，防止流出的胆固醇再进入细胞；以及(c)把HDL胆固醇酯吸收/运输到肝细胞。RCT途径由HDLs介导。HDL是以其高密度为特征的脂蛋白颗粒的通用术语。HDL复合物中主要脂类成分有各种磷脂、胆固醇(酯)以及甘油三脂。最主要的载脂蛋白成分是A-Ⅰ和A-Ⅱ，这二者测定HDL的功能特征；另外还发现少量载脂蛋白C-Ⅰ、C-Ⅱ、C-Ⅲ、D、E、J等。根据在代谢RCT级联反应过程中改形情况，HDL可以多种大小不同以及上述组分间混合比各异的形态存在。参与RCT途径的关键酶是LCAT。LCAT主要由肝生成，并与HDL级分结合循环于血浆中。另外，胆固醇酯转运蛋白(CETP)与另外一种脂类转运蛋白，磷脂转运蛋白(PLTP)参与改形循环HDL群体。CETP能够把LCAT制备的胆固醇酯搬运到其他脂蛋白，具体为含ApoB脂蛋白，例如VLDL和LDL。PLTP向HDL供应卵磷脂。HDL甘油三脂可以被胞外肝甘油三酯脂酶代谢，脂蛋白被肝通过几种机制去除脂蛋白胆固醇。每个HDL颗粒含有至少1个拷贝(通常为2-4拷贝)的ApoA-Ⅰ。ApoA-Ⅰ由肝和小肠作为前载脂蛋白原合成，前栽脂蛋白原以蛋白原分泌，该原蛋白迅速地被切割生成具有243个氨基酸残基的成熟肽。ApoA-Ⅰ主要由6～8个不同的22氨基酸残基重复单元组成，该重复单元被连接单元间隔，该连接单元通常为脯氨酸、某些情况下由数个成串残基构成。ApoA-Ⅰ形成3种类型的含脂稳定复合物称为前-D-1 HDL的小、贫脂复合物；称为前-β-2 HDL的含极性脂类(磷脂和胆固醇)的平盘状颗粒；以及称为球状或成熟HDL(HDL3和HDL2)的同时含极性和非极性脂类的球状颗粒。循环群体中的多数HDL含有ApoA-Ⅰ和ApoA-Ⅱ(次主要HDL蛋白)，本专利技术称其为HDL的AⅠ/AⅡ-HDL级分。但是，只含ApoA-Ⅰ的HDL级分(本专利技术称为AⅠ-HDL级分)本文档来自技高网...
【技术保护点】
编码ＡｐｏＡ－Ⅰ激动剂的核苷酸序列，所述激动剂包括：（ｉ）１５～２９个残基的肽或肽类似物，它能在脂类存在时形成两亲性α螺旋并且包括下列结构通式（Ⅰ）：Ｘ↓［１］－Ｘ↓［２］－Ｘ↓［３］－Ｘ↓［４］－Ｘ↓［５］－Ｘ↓［６］－Ｘ↓［７］ －Ｘ↓［８］－Ｘ↓［９］－Ｘ↓［１０］－Ｘ↓［１１］－Ｘ↓［１２］－Ｘ↓［１３］－Ｘ↓［１４］－Ｘ↓［１５］－Ｘ↓［１６］－Ｘ↓［１７］－Ｘ↓［１８］Ｘ↓［１９］－Ｘ↓［２０］－Ｘ↓［２１］－Ｘ↓［２２］－Ｘ↓［２３］或其药学上可接受的 盐，其中Ｘ↓［１］为Ｐｒｏ（Ｐ）、Ａｌａ（Ａ）、Ｇｌｙ（Ｇ）、Ｇｌｎ（Ｑ）、Ａｓｎ（Ｎ）或Ａｓｐ（Ｄ）；Ｘ↓［２］为脂族残基；Ｘ↓［３］为Ｌｅｕ（Ｌ）或Ｐｈｅ（Ｆ）；Ｘ↓［４］为酸性残基；Ｘ↓［５］为Ｌｅｕ（Ｌ）或Ｐｈｅ （Ｆ）；Ｘ↓［６］为Ｌｅｕ（Ｌ）或Ｐｈｅ（Ｆ）；Ｘ↓［７］为一个亲水性残基；Ｘ↓［８］为一个酸性或碱性残基；Ｘ↓［９］为Ｌｅｕ（Ｌ）或Ｇｌｙ（Ｇ）；Ｘ↓［１０］为Ｌｅｕ（Ｌ）、Ｔｒｐ（Ｗ）或Ｇｌｙ（Ｇ）；Ｘ↓［１１］ 为一个亲水性残基；Ｘ↓［１２］为一个亲水性残基；Ｘ↓［１３］为Ｇｌｙ（Ｇ）或脂族残基；Ｘ↓［１４］为Ｌｅｕ（Ｌ）、Ｔｒｐ（Ｗ）或Ｇｌｙ（Ｇ）；Ｘ↓［１５］为一个亲水性残基；Ｘ↓［１６］为一个疏水性残基；Ｘ↓［１７］为 一个疏水性残基；Ｘ↓［１８］为Ｇｌｎ（Ｑ）、Ａｓｎ（Ｎ）或一个碱性残基；Ｘ↓［１９］为Ｇｌｎ（Ｑ）、Ａｓｎ（Ｎ）或一个碱性残基；Ｘ↓［２０］为一个碱性残基；Ｘ↓［２１］为一个脂族残基；Ｘ↓［２２］为一个碱性残基；Ｘ↓ ［２３］空缺或为一个碱性残基；或者（ｉｉ）结构通式（Ⅰ）的缺失形式，残基Ｘ↓［１］、Ｘ↓［２］、Ｘ↓［３］、Ｘ↓［４］、Ｘ↓［５］、Ｘ↓［６］、Ｘ↓［７］、Ｘ↓［８］、Ｘ↓［９］、Ｘ↓［１０］、Ｘ↓［１１］、Ｘ↓［１２］、Ｘ↓［１３］、 Ｘ↓［１４］、Ｘ↓［１５］、Ｘ↓［１６］、Ｘ↓［１７］、Ｘ↓［１８］、Ｘ↓［１９］、Ｘ↓［２０］、Ｘ↓［２１］和Ｘ↓［２２］中至少有１～８个残基被缺失；或者（ｉｉｉ）结构通式（Ⅰ）的变化形式，残基Ｘ↓［１］、Ｘ↓［２］、Ｘ↓［３］、Ｘ↓ ［４］、Ｘ↓［５］、Ｘ↓［６］、Ｘ↓［７］、Ｘ↓［８］、Ｘ↓［９］、Ｘ↓［１０］、Ｘ↓［１１］、Ｘ↓［１２］、Ｘ↓［１３］、Ｘ...
【技术特征摘要】
...
【专利技术属性】
技术研发人员：琼路易斯达索克斯，雷纳特塞库尔，克劳斯巴特纳，伊莎贝尔康纳特，冈瑟梅茨，琼达弗克，
申请(专利权)人：琼路易斯达索克斯，雷纳特塞库尔，克劳斯巴特纳，
类型：发明
国别省市：US[美国]
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