一种制备人载脂蛋白基因重组蛋白的方法技术

本发明专利技术公开了一种人载脂蛋白ＡｐｏＡＩ＃－［Ｍｉｌａｎｏ］二聚体肽的制备方法，它采用基因重组技术将人的ＡｐｏＡＩ＃－［Ｍｉｌａｎｏ］基因克隆到表达载体上，构建成表达重组质粒，并转化进入大肠杆菌，组建成表达工程菌，经发酵、纯化工艺获得人ＡｐｏＡＩ＃－［Ｍｉｌａｎｏ］蛋白，它可用于治疗急性动脉粥样硬化斑块形成而导致的心绞痛、心肌梗死等冠状动脉综合症。（*该技术在2022年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及基因重组技术，更具体是指采用基因重组技术将人的ApoAIMilano基因克隆到表达载体上，构建成表达重组质粒，并转化进入大肠杆菌，组建成表达工程菌。通过经发酵、纯化工艺获得人ApoA1Milano蛋白。目前世界上有非常好的治疗一般动脉粥样硬化心血管疾病和高血清低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)药，即控制内源性胆固醇合成的HMG-CoA还原酶抑制剂，“他汀”类药。但没有治疗急性动脉粥样硬化心血管病，如心肌梗死、心绞痛药。急性动脉粥样硬化心血管疾病的发病基础主要是由高血清低密度脂蛋白(LDL)携带的胆固醇(LDL-C)在血管壁内集聚，引起动脉粥样硬化斑块的形成。他汀类药的治疗局限性在于只能防止胆固醇进入血管壁，不能清除积聚在血管壁及动脉粥样硬化斑块内的胆固醇，更不能消除血管内壁动脉粥样硬化斑块。ApoAI是HDL的主要功能和结构蛋白成分，也是HDL结合和转运胆固醇的主要作用因子。ApoAI蛋白有一个变异体，它为ApoA1Milano。ApoA1Milano是科学家从一意大利人群中分离到的。该蛋白变异体具有高出ApoAI数倍的结合胆固醇的能力。动物试验显示ApoAI-milano能快速缩小和消除血管壁内动脉粥样硬化斑块。美国Esperion生物技术公司的一期和二期临床试验结果显示其疗效良好。目前已发表的与ApoA1Milano有关的专利有5篇。ApoAIMilano是一种人体内的载脂蛋白，由243个氨基酸组成，其基因全序列为732bp，该蛋白质的等电点在5.16-5.60(J.of Biological Chemistryvol.269，No.51，1994、Nuclear acids Research vol.12，No.9，1984.)。国际上已有专利报道制备ApoAIMilano的方法，采用的是基因融合、大肠杆菌分泌表达的形式。由于ApoAIMilano是一种易于被降解的蛋白分子，所以他们在基因构建上采取基因的5’-端融合了一段IgG结合的Protein A序列，这样表达的蛋白是一种融合蛋白，表达出来后可避免被降解，又可通过亲和层析易于被纯化。在融合DNA片段的结合部位他们还设置了一个能被酸水解的位点，分泌则利用大肠杆菌Omp A信号肽，表达后分泌到培养基中的蛋白通过IgG亲和层析可获得融合蛋白，再通过酸处理去掉IgG结合的Protein A肽段，得到成熟的ApoAIMilano蛋白分子(US5876968)。该方法的不足在于采用IgG亲和层析会使得IgG脱落污染样品，由于IgG本身是蛋白质，这就会造成样品异源蛋白的污染，影响样品的纯度，要去除则十分麻烦，去除不干净容易造成样品用于人体产生过敏反应。本专利技术描述了ApoA1Milano重组蛋白制备的过程及体外试验结果。本专利技术还描述了ApoA1Milano重组蛋白治疗急性动脉粥样硬化心血管疾病中的应用。本专利技术的另一目的是A poAIMilano在治疗心血管疾病中的应用。本专利技术采用的是多聚组氨酸融合基因、大肠杆菌胞内高表达的形式(发酵罐表达已达到1.0-1.3g/L)表达。采用多聚组氨酸(6xHis)融合基因可起到保护表达出来的蛋白不被降解，并且表达出来的蛋白可通过螯合亲和层析方式容易地被纯化。在多聚组氨酸与ApoAIMilano蛋白之间我们也设置了可通过酸被水解的位点，使纯化后的表达蛋白经酸处理后去掉多聚组氨酸小肽。螯合层析的介质是商品化的鎳介质(Ni-NTA)，层析中介质上的鎳离子也会脱落混入样品中，但只要在纯化的样品中加入螯合剂(如EDTA)就可将鎳去除，简单、方便。本专利技术是应用RT-PCR技术从人源细胞-HepG2中首先制备出人ApoAI的基因片段，然后再通过PCR直接位点突变的方法制备成ApoAIMilano基因，该基因先亚克隆到pMD-T载体上，进行基因的DNA序列测定，测定结果完全正确后再将基因从pMD-T载体上切下，克隆到表达载体pMZG上，构建成表达重组质粒。该构建的表达ApoAIMilano的重组质粒转化进入大肠杆菌宿主细胞SG13009，组建成表达工程菌。表达工程菌在发酵罐中发酵是通过30℃培养到OD600＝9-10，升温至37℃，并加入诱导试剂IPTG，通过9小时的诱导后停止发酵，收获菌体。收获的菌体经高压匀浆泵破菌后进行0.22μ的超滤膜过滤除去菌体残渣，再经分子截留为300KD的超滤膜过滤除去核酸等大分子杂质，最后以分子截留为8000Da的超滤膜超滤浓缩蛋白溶液后进行鎳螯合柱亲和层析纯化ApoAIMilano蛋白。收集的鎳螯合柱上洗脱下来的ApoAIMilano蛋白峰溶液调pH至2-2.5进行酸水解，在25℃下水解16-20小时，再鎳柱螯合层析，收集蛋白峰溶液中加入CuCl2作为氧化剂于室温下处理20小时左右，加入EDTA螯合剂进行透析，使得单链的ApoAIMilano在这种处理下形成二聚体肽。纯化得到的ApoAIMilano蛋白进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳检测及体外活性检测和单克隆抗体检测。图7b.pH4.5洗脱收集的人ApoAIMilano蛋白峰液SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳的Western Blotting图谱图8.图中1为标准分子量蛋白，自上而下是97KD、64KD、42KD、31KD、20KD、14KD；2是人Apo AIMilano蛋白的单分子肽，28KD；3是人ApoAIMilano蛋白的二聚体肽，56KD图9.纯化的人ApoAIMilano的体外生物学活性脂结合实验(随着游离脂的逐渐被结合、减少，OD值随之下降) (2)菌种与质粒JM103、DH5α、SG13009为本实验室保存，BMH71/18购自Promega公司，pMD-T购自TaKaRa公司，pMZG为本实验室构建。(3)DNA片段和PCR引物由上海生化细胞研究所合成。(4)试剂抗人ApoA1单克隆抗体购自Chemicon Interational Inc.，Tris和SDS购自AMRESCO，Ni-NTA Agarose构自invitrogen。2、方法(5)ApoAIMilano基因DNA片段制备A.HepG2细胞的总RNA提取HepG2细胞培养至1×106细胞数，在超静工作台内倾去细胞培液，用0.9％的生理盐水洗涤一遍，加入1ml的Trizol试剂(Life Technologies产品)，剧烈振荡，转移至1.5ml的小离心管中，加入0.4ml的氯仿，剧烈振荡后于12500rpm离心5分钟，将上清转移至一根新的无菌1.5ml的小离心管中，加入等体积的重蒸酚，剧烈摇振后将上清转移至一根新的无菌1.5ml的小离心管中，再加入等体积的酚/氯仿(V/V＝1∶1)，同样剧烈摇振后将上清转移至一根新的无菌1.5ml的小离心管中，加入等体积的异丙醇，混匀后于室温放置5分钟，而后以12500rpm离心15分钟，倒去上清，沉淀用70％的乙醇洗涤两遍，然后于超静工作台内敞口放置1小时，挥发掉乙醇，加入50-100□1的灭菌去离子水溶解沉淀，并于分光光度计中以260nm测定其浓度。B.PCR制备ApoAIMilano基因片段采用TaKaRa公司的试剂盒进行反转录和PCR反应。2xBca 1stBuffer 10μl25mM MgSO4本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种人载脂蛋白ＡｐｏＡＩ↓［Ｍｉｌａｎｏ］的制备方法，其特征在于 １－１、采用ＲＴ－ＰＣＲ技术从人肝细胞中获得人载脂蛋白基因片段； １－２、通过ＰＣＲ直接位点突变的方法制得人载脂蛋白基因； １－３、将上述获得的人载脂蛋白基因克隆到ＰＭＤ－Ｔ载体上，进行ＤＮＡ序列测定，然后从ＰＭＤ－Ｔ载体上切下，克隆到表达载体ＰＭＺＧ上，建成表达重组质粒ｐＭＺＧ－３，将此构建的表达人载脂蛋白重组质粒转化进入宿主菌大肠杆菌内，组建成工程菌； １－４、表达工程菌发酵、发酵液处理、纯化，得人载脂蛋白； １－５、纯化的人载脂蛋白用谷胱甘肽、还原型谷胱甘肽处理，形成人载脂蛋白的二聚体肽。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：周鸣南，龚邦强，
申请(专利权)人：上海凯曼生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：31[中国|上海]