一种N-MID骨钙素测定试剂盒及其制备、检测方法技术

本发明专利技术提供了一种N

【技术实现步骤摘要】
一种N
‑
MID骨钙素测定试剂盒及其制备、检测方法


[0001]本专利技术涉及免疫学测定
，尤其涉及一种N
‑
MID骨钙素测定试剂盒及其制备、检测方法。

技术介绍

[0002]骨钙素是成熟成骨细胞分泌的一种非胶原骨基质蛋白，占骨基质中非胶原蛋白成分的25﹪，骨总蛋白的2﹪。完整的骨钙素有49个氨基酸组成，相对分子质量为5800。血清中的骨钙素具有多样性，约三分之一为完整骨钙素，三分之一为N
‑
MID骨钙素(N
‑
MID Osteocalcin)片段，三分之一为氨基酸短肽。骨钙素是成骨细胞功能和骨质矿化的特殊标志物，作为骨转换标志物逐渐被临床应用。
[0003]目前，市场上N
‑
MID骨钙素测定试剂盒以免疫学方法为主，但是现有的检测方法存在一定的缺陷，检测步骤繁琐，操作难度较大，且检测的效率低，精密性不佳，检测的结果受操作的影响，并且价格较高。

技术实现思路

[0004]本专利技术所要解决的技术问题在于提供一种基于胶乳增强免疫比浊法的N
‑
MID骨钙素测定试剂盒及其制备、检测方法，可实现全自动生化分析仪检测N
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MID骨钙素，且操作简便、检测速度快、精密度高、重复性好、成本低。
[0005]本专利技术采用以下技术方案解决上述技术问题：
[0006]一种N
‑
MID骨钙素测定试剂盒，包括试剂R1和试剂R2；
[0007]所述试剂R1包括：Tris缓冲液10～100mmol/L，海藻糖10～50g/L，Genapol X
‑
080 1～5g/L，羟乙基纤维素10～30g/L，蛋白保护剂5～30g/L，防腐剂0.5～1.5g/L；
[0008]所述试剂R2包括：Tris缓冲液10～100mmol/L，海藻糖5～10g/L，Genapol X
‑
080 0.1～5g/L，N
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MID骨钙素单克隆抗体50～100mg/L，乳胶微球颗粒0.5％～3％，蛋白保护剂1～20g/L，防腐剂0.1～5g/L。
[0009]作为本专利技术的优选方式之一，所述试剂R1和试剂R2中的蛋白保护剂为甘油、牛血清白蛋白、酪蛋白、小牛血清、蔗糖中的一种或多种。
[0010]作为本专利技术的优选方式之一，所述试剂R1和试剂R2中的防腐剂为叠氮化钠、庆大霉素、硫柳汞、Proclin300中的一种或多种。
[0011]作为本专利技术的优选方式之一，所述试剂R2中，N
‑
MID骨钙素单克隆抗体为鼠抗人N
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MID骨钙素单克隆抗体、羊抗人N
‑
MID骨钙素单克隆抗体、兔抗人N
‑
MID骨钙素单克隆抗体中的至少一种。
[0012]作为本专利技术的优选方式之一，所述试剂R2中，乳胶微球颗粒的粒径为150～400nm；所述乳胶微球颗粒与N
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MID骨钙素单克隆抗体交联反应结合，形成包被有N
‑
MID骨钙素单克隆抗体的胶乳微球；该过程中，Hepes缓冲液作为偶联缓冲液，Gly缓冲液作为稀释缓冲液。
[0013]作为本专利技术的优选方式之一，所述包被有N
‑
MID骨钙素单克隆抗体的胶乳微球的
制备方法为：
[0014]①
取胶乳微球加入到偶联缓冲液中混合均匀，接着置于恒温搅拌器中预热15～25min，温度：30～37℃；
[0015]②
加入活化剂EDC溶液和NHS溶液，混匀，并置于恒温搅拌器中反应10～20min，温度：30～37℃；
[0016]③
加入N
‑
MID骨钙素单克隆抗体，混匀，并置于恒温搅拌器中反应100～140min，温度：30～37℃；
[0017]④
加入封闭液，混匀，并置于恒温搅拌器中反应25～35h，温度：30～37℃；
[0018]⑤
置于高速离心机中10000～20000rpm离心10～30min，温度：0～10℃；
[0019]⑥
加入稀释缓冲液，置于冰水浴中，放置于超声波细胞破碎仪中充分分散3～10min，功率200～300W。
[0020]一种N
‑
MID骨钙素测定试剂盒的制备方法，包括如下步骤：
[0021](1)配制试剂R1：
[0022]按照试剂R1的组分含量，将各组分于同一容器中混合，混合均匀后，制得试剂R1；
[0023](2)配制试剂R2的稀释缓冲液：
[0024]按照试剂R2的组分含量，将Tris缓冲液、海藻糖、Genapol X
‑
080、蛋白保护剂、防腐剂进行混合，获得试剂R2的稀释缓冲液；
[0025](3)配制试剂R2：
[0026]①
取胶乳微球加入到偶联缓冲液中混合均匀，接着置于恒温搅拌器中预热15～25min，温度：30～37℃；
[0027]②
加入活化剂EDC溶液和NHS溶液，混匀，并置于恒温搅拌器中反应10～20min，温度：30～37℃；
[0028]③
加入N
‑
MID骨钙素单克隆抗体，混匀，并置于恒温搅拌器中反应100～140min，温度：30～37℃；
[0029]④
加入封闭液，混匀，并置于恒温搅拌器中反应25～35h，温度：30～37℃；
[0030]⑤
置于高速离心机中10000～20000rpm离心10～30min，温度：0～10℃；
[0031]⑥
加入稀释缓冲液，置于冰水浴中，放置于超声波细胞破碎仪中充分分散3～10min，功率200～300W，制得包被有N
‑
MID骨钙素单克隆抗体的胶乳微球；
[0032]⑦
将包被有N
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MID骨钙素单克隆抗体的胶乳微球加入到步骤(2)制得的稀释缓冲液中，并置于恒温搅拌器中充分分散30～40min，温度：30～37℃，制得试剂R2。
[0033]一种N
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MID骨钙素测定试剂盒的检测方法，包括如下步骤：
[0034](1)吸取5μL样本，加入60μL试剂R1，37℃孵育3～5min；
[0035](2)再加入180μL试剂R2，置于37℃孵育；
[0036](3)孵育20s后，采用全自动生化分析仪，于570nm波长下测定吸光值Al；再孵育5min，相同波长下检测吸光度值A2；
[0037](4)按照
△
A＝A2
‑
A1来计算吸光度变化值ΔA，并根据ΔA计算出样本中N
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MID骨钙素含量。
[0038]本专利技术基于胶乳增强免疫比浊法测定的N
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MID骨钙素试剂盒，其原理是采用化学偶联法将特异性抗本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种N
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MID骨钙素测定试剂盒，其特征在于，包括试剂R1和试剂R2；所述试剂R1包括：Tris缓冲液10～100mmol/L，海藻糖10～50g/L，Genapol X
‑
080 1～5g/L，羟乙基纤维素10～30g/L，蛋白保护剂5～30g/L，防腐剂0.5～1.5g/L；所述试剂R2包括：Tris缓冲液10～100mmol/L，海藻糖5～10g/L，Genapol X
‑
080 0.1～5g/L，N
‑
MID骨钙素单克隆抗体50～100mg/L，乳胶微球颗粒0.5％～3％，蛋白保护剂1～20g/L，防腐剂0.1～5g/L。2.根据权利要求1所述的N
‑
MID骨钙素测定试剂盒，其特征在于，所述试剂R1和试剂R2中的蛋白保护剂为甘油、牛血清白蛋白、酪蛋白、小牛血清、蔗糖中的一种或多种。3.根据权利要求1所述的N
‑
MID骨钙素测定试剂盒，其特征在于，所述试剂R1和试剂R2中的防腐剂为叠氮化钠、庆大霉素、硫柳汞、Proclin300中的一种或多种。4.根据权利要求1所述的N
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MID骨钙素测定试剂盒，其特征在于，所述试剂R2中，N
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MID骨钙素单克隆抗体为鼠抗人N
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MID骨钙素单克隆抗体、羊抗人N
‑
MID骨钙素单克隆抗体、兔抗人N
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MID骨钙素单克隆抗体中的至少一种。5.根据权利要求1所述的N
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MID骨钙素测定试剂盒，其特征在于，所述试剂R2中，乳胶微球颗粒的粒径为150～400nm；所述乳胶微球颗粒与N
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MID骨钙素单克隆抗体交联反应结合，形成包被有N
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MID骨钙素单克隆抗体的胶乳微球；该过程中，Hepes缓冲液作为偶联缓冲液，Gly缓冲液作为稀释缓冲液。6.根据权利要求5所述的N
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MID骨钙素测定试剂盒，其特征在于，所述包被有N
‑
MID骨钙素单克隆抗体的胶乳微球的制备方法为：
①
取胶乳微球加入到偶联缓冲液中混合均匀，接着置于恒温搅拌器中预热15～25min，温度：30～37℃；
②
加入活化剂EDC溶液和NHS溶液，混匀，并置于恒温搅拌器中反应10～20min，温度：30～37℃；
③
加入N
‑
MID骨钙素单克隆抗体，混匀，并置于恒温搅拌器中反应100～140min，温度：30～37℃；
④...

【专利技术属性】
技术研发人员：芮双印，侯珂，
申请(专利权)人：安徽大千生物工程有限公司，
类型：发明
国别省市：