一种产磷脂酶D的SBT5工程菌及其构建方法与应用技术

本发明专利技术涉及基因工程技术领域，提供了一种产磷脂酶D的SBT5工程菌。本发明专利技术还提供了上述产磷脂酶D的SBT5工程菌的构建方法，方法如下：磷脂酶D基因的定点突变、突变体的筛选、磷脂酶D基因突变体的糖基化位点分析、糖基化位点定点优化及全基因合成、初步工程菌的获得、pMS82

【技术实现步骤摘要】
一种产磷脂酶D的SBT5工程菌及其构建方法与应用


[0001]本专利技术涉及基因工程
，尤其涉及一种产磷脂酶D的SBT5工程菌及其构建方法与应用。

技术介绍

[0002]磷脂酶D(Phospholipase D，简称PLD，EC 3.1.4.4)是作用于磷脂分子中磷酸与有机碱间磷酰氧键(P
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O)的一类酶。磷脂酶D的作用是水解磷脂，催化磷脂分子中磷酸与取代基团(如胆碱等)间的酯键，释放其他脂蛋白中的胆固醇和游离胆固醇。PLD分布在从细菌到高等动植物的许多生物类群中，其在生物体内的主要生理功能是参与细胞脂质代谢，信号转导及生物膜形成等。在体外，PLD也已成为合成和改造磷脂质的重要工具酶，基于PLD所特有的碱基交换活性可对磷脂进行改性，制备高纯度的单一磷脂、稀有磷脂及系列功能性磷脂，使其在食品和医药工业中具有极大的应用价值。因此，开发有工业应用价值的PLD具有重要的战略意义和发展前景。然而，虽然磷脂酶D广泛分布于病毒、动物、植物和微生物中，动物脑组织中亦有，但含量并不高，所以提取工艺较为复杂，这就造成磷脂酶D的价格较为昂贵。
[0003]目前，国内用基因工程技术制备PLD的研究方面，相较于其他类型酶蛋白(蛋白酶、脂肪酶等)，还处于起步阶段，基本上都停留在实验室最初级水平。而国外对微生物PLD的研究已较为成熟，一些酶制剂公司已筛选出高产PLD的链霉菌菌株，如Sigma
‑
Aldrich公司的Streptomyces sp.PLD酶制剂，而商品化PLD的价格非常昂贵，每毫克售价约一千元人民币左右。对进口酶源的高度依赖严重影响了我国生化产业的发展，其中也包括体外诊断试剂的自主研发。
[0004]对此，本申请单位研发了多种产磷脂酶D的基因工程菌，并就其中的一种“产磷脂酶D的毕赤酵母工程菌”申请了专利(专利名称为“一种产磷脂酶D的基因工程菌及其构建方法与在sdLDL
‑
C检测试剂盒开发中的应用”，授权公告号为CN 112899178B)，该工程菌能够高效表达PLD蛋白，将其替代现有sdLDL
‑
C检测试剂盒中的进口PLD，可降低生产成本。然而，上述工程菌仍存在一些不足之处，例如，表达的PLD蛋白水解酶活仍有提升空间，造成检测用量无法精简，无法最大化地降低应用成本。

技术实现思路

[0005]本专利技术所要解决的技术问题在于提供一种产磷脂酶D的SBT5工程菌及其构建方法与应用，利用该基因工程菌生产的PLD蛋白具有更高的水解酶活，将其替代现有sdLDL
‑
C检测试剂盒中的进口PLD，可最大程度地降低成本。
[0006]本专利技术采用以下技术方案解决上述技术问题：
[0007]一种产磷脂酶D的SBT5工程菌，所述工程菌包括如SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列。
[0008]一种产磷脂酶D的SBT5工程菌的构建方法，包括如下步骤：
[0009](1)磷脂酶D基因的定点突变
[0010]选择S.chromofuscus色褐链霉菌来源的磷脂酶D作为野生型磷脂酶D的目的基因，基因序列如SEQ ID NO.1所示；
[0011]对所述目的基因进行定点突变，将目的基因中的连续两个丙氨酸Ala利用人工诱导突变为两个甘氨酸Gly，以获得适合在变铅青链霉菌SBT5中高效表达的基因序列，突变后的基因序列如SEQ ID NO.2所示；
[0012](2)突变体的筛选
[0013]剔除掉突变不完全、诱变不彻底的基因，选择突变完全、序列清晰的目的基因进行下一步操作；
[0014](3)磷脂酶D基因突变体的糖基化位点分析
[0015]将定点突变后的磷脂酶D基因利用相关软件分析蛋白的糖基化位点；
[0016](4)糖基化位点定点优化及全基因合成
[0017]为了消除潜在的被糖基化修饰位点影响，将潜在的糖基化位点的脯氨酸Pro优化为精氨酸Arg，并将糖基化位点改造后的序列进行全基因合成；最终改造后的基因序列如SEQ ID NO.3所示；
[0018](5)初步工程菌的获得
[0019]将步骤(4)完成的序列连接在pMS82载体上，且基因上下游分别插入NotI和EcoRI酶切位点，接着转化入SBT5菌获得初步工程菌；
[0020](6)pMS82
‑
PLDAnti质粒的抽提
[0021]对步骤(5)得到的初步工程菌进行质粒提取，并采用琼脂糖凝胶电泳检测提取质粒的质量，检测合格的pMS82
‑
PLDAnti质粒继续用于后续实验；
[0022](7)重组链霉菌菌株的构建
[0023]将检测合格的pMS82
‑
PLDAnti质粒转入变铅青链霉菌SBT5，即得目标所需的产磷脂酶D的SBT5工程菌。
[0024]作为本专利技术的优选方式之一，所述步骤(2)中，采用定量PCR或荧光免疫原位杂交检测目的基因的突变情况，剔除掉突变不完全、诱变不彻底的基因，选择突变完全、序列清晰的目的基因进行下一步操作。
[0025]作为本专利技术的优选方式之一，所述步骤(3)中，利用NetNGlyc 1.0 Server在线软件分析蛋白的糖基化位点。
[0026]一种上述产磷脂酶D的SBT5工程菌在sdLDL
‑
C检测试剂盒开发中的应用，利用所述产磷脂酶D的SBT5工程菌所产生的磷脂酶D作为催化剂生产sdLDL
‑
C检测试剂盒。
[0027]作为本专利技术的优选方式之一，利用所述SBT5工程菌获得磷脂酶D的方法为：
[0028](1)重组PLD蛋白的摇瓶发酵
[0029]①
将SBT5工程菌菌株，接种至5mL BMGY试管中，27℃，250～280rpm过夜培养；
[0030]②
将过夜培养的菌液按2％的接种量转接至含有50mL ISP2培养基的摇瓶中，27℃，250～280rpm培养至OD
600
＝2～6；
[0031]③
用无菌的离心管，1500～3000
×
g离心收集细胞。诱导表达时，去除上清，用牛肉膏蛋白胨培养基重悬细胞至OD
600
＝1.0进行诱导表达；
[0032]④
每24小时，加甲醇至最适终浓度诱导蛋白的表达，同样取出与加入甲醇量相同
体积的菌液，用于链霉菌生物量的测定；
[0033]⑤
48小时后分别取6mL菌液，离心获取上清液，进行浓缩；SDS
‑
PAGE检测PLD蛋白是否成功表达；
[0034](2)纯化PLD蛋白的获取
[0035]①
蛋白上清液的制备
[0036]将摇瓶发酵6天的菌液分装在离心瓶中，6000
×
g离心30min收集上清液，把得到的上清液置于4℃冰箱保存，以备后续实验利用；
[0037]②
PLD本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种产磷脂酶D的SBT5工程菌，其特征在于，所述工程菌包括如SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列。2.一种产磷脂酶D的SBT5工程菌的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)磷脂酶D基因的定点突变选择S.chromofuscus色褐链霉菌来源的磷脂酶D作为野生型磷脂酶D的目的基因，基因序列如SEQ ID NO.1所示；对所述目的基因进行定点突变，将目的基因中的连续两个丙氨酸Ala利用人工诱导突变为两个甘氨酸Gly，以获得适合在变铅青链霉菌SBT5中高效表达的基因序列，突变后的基因序列如SEQ ID NO.2所示；(2)突变体的筛选剔除掉突变不完全、诱变不彻底的基因，选择突变完全、序列清晰的目的基因进行下一步操作；(3)磷脂酶D基因突变体的糖基化位点分析将定点突变后的磷脂酶D基因利用相关软件分析蛋白的糖基化位点；(4)糖基化位点定点优化及全基因合成为了消除潜在的被糖基化修饰位点影响，将潜在的糖基化位点的脯氨酸Pro优化为精氨酸Arg，并将糖基化位点改造后的序列进行全基因合成；最终改造后的基因序列如SEQ ID NO.3所示；(5)初步工程菌的获得将步骤(4)完成的序列连接在pMS82载体上，且基因上下游分别插入NotI和EcoRI酶切位点，接着转化入SBT5菌获得初步工程菌；(6)pMS82
‑
PLDAnti质粒的抽提对步骤(5)得到的初步工程菌进行质粒提取，并采用琼脂糖凝胶电泳检测提取质粒的质量，检测合格的pMS82
‑
PLDAnti质粒继续用于后续实验；(7)重组链霉菌菌株的构建将检测合格的pMS82
‑
PLDAnti质粒转入变铅青链霉菌SBT5，即得目标所需的产磷脂酶D的SBT5工程菌。3.根据权利要求2所述的产磷脂酶D的SBT5工程菌的构建方法，其特征在于，所述步骤(2)中，采用定量PCR或荧光免疫原位杂交检测目的基因的突变情况，剔除掉突变不完全、诱变不彻底的基因，选择突变完全、序列清晰的目的基因进行下一步操作。4.根据权利要求2所述的产磷脂酶D的SBT5工程菌的构建方法，其特征在于，所述步骤(3)中，利用NetNGlyc 1.0Server在线软件分析蛋白的糖基化位点。5.一种如权利要求1所述的产磷脂酶D的SBT5工程菌在sdLDL
‑
C检测试剂盒开发中的应用，其特征在于，利用所述产磷脂酶D的SBT5工程菌所产生的磷脂酶D作为催化剂生产sdLDL
‑
C检测试剂盒。6.根据权利要求5所述的产磷脂酶D的SBT5工程菌在sdLDL
‑
C检测试剂盒开发中的应用，其特征在于，利用所述SBT5工程菌获得磷脂酶D的方法为：(1)重组PLD蛋白的摇瓶发酵
①
将SBT5工程菌菌株，接种至5mL BMGY试管中，27℃，250～280rpm过夜培养；
②
将过夜培养的菌液按2％的接种量转接至含有50mLISP2培养基的摇瓶中，27℃，250～280rpm培养至OD
600
＝2～6；
③
用无菌的离心管，1500～3000
×
g离心收集细胞。诱导表达时，去除上清，用牛肉膏蛋白胨培养基...

【专利技术属性】
技术研发人员：芮双印，朱鹏翔，
申请(专利权)人：安徽大千生物工程有限公司，
类型：发明
国别省市：