本发明专利技术提供了一种基于胶乳增强免疫比浊法的P1NP测定试剂盒，包括试剂R1和试剂R2；所述试剂R1包括：R1缓冲液、表面活性剂、稳定剂、防腐剂、增敏剂；所述试剂R2包括：R2缓冲液、表面活性剂、稳定剂、P1NP抗体、100～120nm乳胶微球颗粒、120～150nm乳胶微球颗粒、防腐剂、活化缓冲液，偶联缓冲液。本发明专利技术还提供了上述测定试剂盒的制备与测定方法。本发明专利技术的优点在于：不仅操作简便、检测时间短、测定成本低，同时还具备较高灵敏度、精密度和准确度。精密度和准确度。精密度和准确度。
【技术实现步骤摘要】
一种基于胶乳增强免疫比浊法的P1NP测定试剂盒及其制备与检测方法
[0001]本专利技术涉及免疫学测定领域，尤其涉及一种基于胶乳增强免疫比浊法的P1NP测定试剂盒及其制备与检测方法。
技术介绍
[0002]目前，P1NP的检测方法主要有酶联免疫吸附测定法(ELISA)和化学发光免疫分析法(CLIA)。其中，酶联免疫吸附测定法，是利用已知抗体与抗原的特异结合，再加入能与待测抗原产生特异反应的酶联抗体，最后加入相应酶的底物，抗原含量根据有色酶解产物的颜色深浅来判断；该方法检测灵敏度高，但操作过程略显复杂、测定时间较长、影响因素多，且此法多用于科学研究，不能用于临床诊断。化学发光免疫分析法，是将免疫反应与发光反应相结合的一种定量分析技术，运用抗原抗体反应，再利用某些化合物被氧化剂氧化或催化剂催化后，由激发态到基态转换从而将剩余能量转变为光子，利用这些原理，将发光物质标记于抗原或抗体上，其产生的光量子强度与所测抗原浓度成比例；该技术自动化操作速度快、准确度高，具有一定的临床应用价值，但成本高、设备昂贵、稳定性较差，无法普及中基层医院及医疗机构。
[0003]胶乳增强免疫比浊法(PETIA)，是利用抗原抗体的特异性结合，在纳米尺度的胶乳微球的表面交联或物理吸附抗体，试剂反应液中交联有抗体的微球与样本中的抗原结合后，在短时间内会迅速聚集在一起，形成浊度，从而改变反应液的散光性能或透光性能，在线性范围内可以反映被测抗原的浓度。胶乳增强免疫比浊法的优点是操作简便，几分钟就能获得结果。此外，全自动免疫比浊法操作步骤的简化也相应地避免了许多人为操作因素和试剂、环境等外界因素的干扰，稳定性和重复性都较好，能较真实地反映被测物质的含量。
技术实现思路
[0004]本专利技术所要解决的技术问题在于提供一种基于胶乳增强免疫比浊法的P1NP测定试剂盒及其制备与检测方法。
[0005]本专利技术采用以下技术方案解决上述技术问题：
[0006]一种基于胶乳增强免疫比浊法的P1NP测定试剂盒，包括试剂R1和试剂R2；所述试剂R1包括：R1缓冲液20～50mmol/L，表面活性剂5～30mL/L，稳定剂5～20g/L，防腐剂0.05～2g/L，增敏剂10～30g/L；所述试剂R2包括：R2缓冲液20～50mmol/L，表面活性剂5～20mL/L，稳定剂5～30g/L，P1NP抗体0.8～1.2ug/mL，100～120nm乳胶微球颗粒1～15ml/L，120～150nm乳胶微球颗粒1～15ml/L，防腐剂0.05～2g/L，活化缓冲液20～50mmol/L，偶联缓冲液20～50mmol/L。
[0007]作为本专利技术的优选方式之一，所述R1缓冲液、R2缓冲液、活化缓冲液与偶联缓冲液分别为硼酸缓冲液、硼酸钠缓冲液、甘氨酸缓冲液、磷酸盐缓冲液、Hepes缓冲液、Tris
‑
HCl
缓冲液、Good's缓冲液中的一种。
[0008]作为本专利技术的优选方式之一，所述表面活性剂为吐温
‑
20，曲拉通X
‑
100，丙三醇中的至少一种。
[0009]作为本专利技术的优选方式之一，所述稳定剂为蔗糖、乙二胺四乙酸二钠、海藻糖、甘油、明胶、小牛血清白蛋白、酪蛋白中的至少一种。
[0010]作为本专利技术的优选方式之一，所述防腐剂为叠氮化钠、庆大霉素、硫柳汞、Proclin300、异噻唑啉酮中的至少一种。
[0011]作为本专利技术的优选方式之一，所述增敏剂为聚乙二醇6000、氟化钠中的至少一种。
[0012]作为本专利技术的优选方式之一，所述P1NP抗体为鼠抗人P1NP单克隆抗体、羊抗人P1NP单克隆抗体、兔抗人P1NP单克隆抗体中的至少一种，或者是，鼠抗人P1NP多克隆抗体、羊抗人P1NP多克隆抗体、兔抗人P1NP多克隆抗体中的至少一种。
[0013]作为本专利技术的优选方式之一，所述P1NP抗体分别与100～120nm乳胶微球颗粒、120～150nm乳胶微球颗粒偶联反应结合，形成包被有P1NP抗体的两不同粒径胶乳微球。
[0014]一种上述基于胶乳增强免疫比浊法的P1NP测定试剂盒的制备方法，包括如下步骤：
[0015](1)配制试剂R1：
[0016]按照试剂R1的组分含量，将各组分于同一容器中混合，混合均匀后，制得试剂R1；
[0017](2)配制试剂R2的稀释缓冲液：
[0018]按照试剂R2的组分含量，将R2缓冲液、表面活性剂、稳定剂和防腐剂进行混合，获得试剂R2的稀释缓冲液；
[0019](3)配制试剂R2：
[0020]①
按1:1的比例取粒径为100～120nm的胶乳微与粒径为120～150nm的胶乳微球，加入活化缓冲液后充分混匀，置于恒温摇床中反应30～50min，温度范围：30～37℃，转速200～500rpm/min；
[0021]②
加入P1NP抗体，混匀，并置于恒温摇床中反应30～50min，温度范围：30～37℃，转速200～500rpm/min；
[0022]③
加入活化剂，混匀，并置于恒温摇床中反应1～2h，温度范围：30～37℃，转速200～500rpm/min；
[0023]④
加入封闭液，混匀，并置于恒温摇床中反应2～3h，温度范围：30～37℃，转速200～500rpm/min；
[0024]⑤
加入偶联缓冲液，调整溶液的pH值至7.0～8.0；
[0025]⑥
反应完成后，离心用冷冻离心机去除上清液，温度为4℃，转速为20000rpm，离心时间为30～50min；
[0026]⑦
去除上清液，并用步骤(2)的稀释缓冲液进行复溶，重悬胶乳微球；重悬过程中使用细胞破碎仪辅助重悬，超声4～6min，功率210～300W，隔1S超1S，制得试剂R2。
[0027]作为本专利技术的优选方式之一，活化剂：NHS 25mg/mL，EDC 9.0mg/mL，现配现用；封闭液：BSA 10g/L。
[0028]一种上述基于胶乳增强免疫比浊法的P1NP测定试剂盒的检测方法，包括如下步骤：
[0029](1)吸取10μL样本，加入240μL试剂R1，37℃孵育3～5min；
[0030](2)再加入60μL试剂R2，置于37℃孵育；
[0031](3)孵育20s后，采用全自动生化分析仪，于600nm波长下测定吸光值Bl；再孵育5min，相同波长下检测吸光度值B2；
[0032](4)按照
△
B＝B2
‑
B1来计算吸光度变化值ΔB，并根据ΔB计算出样本中P1NP含量。
[0033]作为本专利技术的优选方式之一，通过将ΔB代入“吸光度变化值与P1NP浓度的线性关系公式”来确定P1NP含量；其中，”吸光度变化值与P1NP浓度的线性关系公式”通过如下方法获得：
[0034](1)配制校准品缓冲液：
[0035]校准品本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
1.一种基于胶乳增强免疫比浊法的P1NP测定试剂盒，其特征在于，包括试剂R1和试剂R2；所述试剂R1包括：R1缓冲液20～50mmol/L，表面活性剂5～30mL/L，稳定剂5～20g/L，防腐剂0.05～2g/L，增敏剂10～30g/L；所述试剂R2包括：R2缓冲液20～50mmol/L，表面活性剂5～20mL/L，稳定剂5～30g/L，P1NP抗体0.8～1.2ug/mL，100～120nm乳胶微球颗粒1～15ml/L，120～150nm乳胶微球颗粒1～15ml/L，防腐剂0.05～2g/L，活化缓冲液20～50mmol/L，偶联缓冲液20～50mmol/L。2.根据权利要求1所述的基于胶乳增强免疫比浊法的P1NP测定试剂盒，其特征在于，所述R1缓冲液、R2缓冲液、活化缓冲液与偶联缓冲液分别为硼酸缓冲液、硼酸钠缓冲液、甘氨酸缓冲液、磷酸盐缓冲液、Hepes缓冲液、Tris
‑
HCl缓冲液、Good's缓冲液中的一种。3.根据权利要求1所述的基于胶乳增强免疫比浊法的P1NP测定试剂盒，其特征在于，所述表面活性剂为吐温
‑
20，曲拉通X
‑
100，丙三醇中的至少一种。4.根据权利要求1所述的基于胶乳增强免疫比浊法的P1NP测定试剂盒，其特征在于，所述稳定剂为蔗糖、乙二胺四乙酸二钠、海藻糖、甘油、明胶、小牛血清白蛋白、酪蛋白中的至少一种。5.根据权利要求1所述的基于胶乳增强免疫比浊法的P1NP测定试剂盒，其特征在于，所述防腐剂为叠氮化钠、庆大霉素、硫柳汞、Proclin300、异噻唑啉酮中的至少一种。6.根据权利要求1所述的基于胶乳增强免疫比浊法的P1NP测定试剂盒，其特征在于，所述增敏剂为聚乙二醇6000、氟化钠中的至少一种。7.根据权利要求1所述的基于胶乳增强免疫比浊法的P1NP测定试剂盒，其特征在于，所述P1NP抗体为鼠抗人P1NP单克隆抗体、羊抗人P1NP单克隆抗体、兔抗人P1NP单克隆抗体中的至少一种，或者是，鼠抗人P1NP多克隆抗体、羊抗人P1NP多克隆抗体、兔抗人P1NP多克隆抗体中的至少一种。8.根据权利要求1所述的基于胶乳增强免疫比浊法的P1NP测定试剂盒，其特征在于，所述P1NP抗体分别与100～120nm乳胶微球颗粒、120～150nm乳胶微球颗粒偶联反应结合，形...
【专利技术属性】
技术研发人员：芮双印，滕安然，
申请(专利权)人：安徽大千生物工程有限公司，
类型：发明
国别省市：
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