本发明专利技术提供了一种胶乳增强免疫比浊法测定CTX的试剂盒，包括试剂R1和试剂R2；所述试剂R1包括：R1缓冲液、稳定剂、防腐剂、增敏剂；所述试剂R2包括：R2缓冲液、表面活性剂、稳定剂、CTX抗体、100～150nm乳胶微球颗粒、160～200nm乳胶微球颗粒、防腐剂、活化缓冲液、偶联缓冲液。本发明专利技术还提供了上述试剂盒的制备与测定方法。本发明专利技术的优点在于：不仅操作简便、检测时间短、测定成本低，同时还具备较高灵敏度、精密度和准确度。准确度。准确度。
【技术实现步骤摘要】
一种胶乳增强免疫比浊法测定CTX的试剂盒及其制备检测方法
[0001]本专利技术涉及免疫学测定领域，尤其涉及一种胶乳增强免疫比浊法测定CTX的试剂盒及其制备检测方法。
技术介绍
[0002]目前，I型胶原C末端肽(CTX)的检测方法有酶联免疫吸附测定法(ELISA)、放射性免疫分析法(RIA、IAIR)和免疫浊度法(INA、ITA)。在酶联免疫吸附测定中，其检测灵敏度高，但操作过程略显复杂、测定时间较长、影响因素多，无法普及中基层医院及医疗机构。在放射性免疫分析法测定中，其具有灵敏度高和特异性强的优点，但是存在放射污染、重复性差、非特异性结合率高的劣势，且此法主要应用于科学研究，不能用于临床诊断。免疫浊度法又可分为散射比浊法(INA)和透射比浊法(ITA)，这类方法的优点是快速简便，精密度高、易于自动化，适于大批量标本的同时检测，也可进行少量样本和急诊样本的测定，具有很强的适用性。其中，散射比浊法(INA)由于其光波接收方式的特点，通常测试结果的灵敏度与测速要优于透射比浊，但需要专门仪器的散射比浊仪或特种蛋白仪，与专用配套试剂，测定成本较高，不易于在基层医院中推广使用；透射比浊法(ITA)，其操作简便适用性强，普通自动生化分析仪和分光光度计均可使用，更易于被常规分析所采用，几乎所有的各实验室、基层医院均能开展，不足的是灵敏度和精密度均不够理想。
[0003]胶乳增强免疫比浊法(PETIA)，是利用抗原抗体的特异性结合，在纳米尺度的胶乳微球的表面交联或物理吸附抗体，试剂反应液中交联有抗体的微球与样本中的抗原结合后，在短时间内会迅速聚集在一起，形成浊度，从而改变反应液的散光性能或透光性能，在线性范围内可以反映被测抗原的浓度。胶乳增强免疫比浊法的优点是成本不高，操作简便，几分钟就能获得结果。此外，全自动免疫比浊法操作步骤的简化也相应地避免了许多人为操作因素和试剂、环境等外界因素的干扰，稳定性和重复性都较好，能较准确地反映被测物质的含量。
技术实现思路
[0004]本专利技术所要解决的技术问题在于提供一种胶乳增强免疫比浊法测定CTX的试剂盒及其制备检测方法；本专利技术通过放大抗体抗原反应以及添加稳定剂、表面活性剂等优化反应体系，增加免疫复合物的直径，提高检测敏感性和测定试剂的分析灵敏度及精密度；通过不同粒径的胶乳微球组合，使该I型胶原C末端肽测定试剂的性能达到更宽线性范围，实现对I型胶原C末端肽的准确检测；同时，适用于多种全自动生化分析仪，适于大批量标本的同时检测，也可进行少量样本和急诊样本的测定，具有广泛的通用性，且未提高试剂研发成本，更易适应现代化临床检验医学的发展。
[0005]本专利技术采用以下技术方案解决上述技术问题：
[0006]一种胶乳增强免疫比浊法测定CTX的试剂盒，包括试剂R1和试剂R2；所述试剂R1包
括：R1缓冲液5～20mmol/L，稳定剂8～10g/L，防腐剂1～1.5g/L，增敏剂15～25g/L；所述试剂R2包括：R2缓冲液50～100mmol/L，表面活性剂0.05～1g/L，稳定剂6～8g/L，CTX抗体10～20mg/L，100～150nm乳胶微球颗粒5～10ml/L，160～200nm乳胶微球颗粒5～10ml/L，防腐剂1～1.5g/L，活化缓冲液50～100mmol/L，偶联缓冲液20～100mmol/L。
[0007]作为本专利技术的优选方式之一，所述R1缓冲液、R2缓冲液、活化缓冲液与偶联缓冲液分别为硼酸缓冲液、硼酸钠缓冲液、甘氨酸缓冲液、磷酸盐缓冲液、Hepes缓冲液、Tris
‑
HCl缓冲液中的一种。
[0008]作为本专利技术的优选方式之一，所述稳定剂为蔗糖、乙二胺四乙酸二钠、海藻糖、甘油、明胶、小牛血清白蛋白、酪蛋白中的至少一种。
[0009]作为本专利技术的优选方式之一，所述防腐剂为叠氮化钠、庆大霉素、硫柳汞、Proclin300、异噻唑啉酮中的至少一种。
[0010]作为本专利技术的优选方式之一，所述增敏剂为聚乙二醇6000、氟化钠中的至少一种。
[0011]作为本专利技术的优选方式之一，所述表面活性剂为吐温
‑
20，曲拉通X
‑
100，丙三醇中的至少一种。
[0012]作为本专利技术的优选方式之一，所述CTX抗体为人I型胶原C末端肽单克隆抗体、大鼠I型胶原C末端肽单克隆抗体中的至少一种，或者是，人I型胶原C末端肽多克隆抗体、大鼠I型胶原C末端肽多克隆抗体中的至少一种。
[0013]作为本专利技术的优选方式之一，所述CTX抗体分别与100～150nm乳胶微球颗粒、160～200nm乳胶微球颗粒偶联反应结合，形成包被有CTX抗体的两不同粒径胶乳微球。
[0014]一种上述胶乳增强免疫比浊法测定CTX的试剂盒的制备方法，包括如下步骤：
[0015](1)配制试剂R1：
[0016]按照试剂R1的组分含量，将各组分于同一容器中混合，混合均匀后，制得试剂R1；
[0017](2)配制试剂R2的稀释缓冲液：
[0018]按照试剂R2的组分含量，将R2缓冲液、表面活性剂、稳定剂和防腐剂进行混合，获得试剂R2的稀释缓冲液；
[0019](3)配制试剂R2：
[0020]①
按1:1的比例取粒径为100～150nm的胶乳微与粒径为160～200nm的胶乳微球，加入活化缓冲液后充分混匀；
[0021]②
加入活化剂，混匀，并置于恒温摇床中反应20～30min，温度范围：35～40℃；
[0022]③
加入偶联缓冲液；
[0023]④
加入CTX抗体，混匀，并置于恒温摇床中反应2～3h，温度范围：30～37℃；
[0024]⑤
加入封闭液，混匀，并置于恒温摇床中反应1～2h，温度范围：30～37℃；
[0025]⑥
反应完成后，离心并去除上清液，转速为16000rpm，离心时间为35min；
[0026]⑦
去除上清液，并用步骤(2)的稀释缓冲液进行复溶，重悬胶乳微球；重悬过程中使用细胞破碎仪辅助重悬，制得试剂R2。
[0027]作为本专利技术的优选方式之一，活化剂：NHS25mg/mL，EDC9.0mg/mL，现配现用；封闭液：BSA10g/L。
[0028]一种上述胶乳增强免疫比浊法测定CTX的试剂盒的检测方法，包括如下步骤：
[0029](1)吸取10μL样本，加入240μL试剂R1，37℃孵育3～5min；
[0030](2)再加入60μL试剂R2，置于37℃孵育；
[0031](3)孵育20s后，采用全自动生化分析仪，于470nm波长下测定吸光值A1；再孵育5min，相同波长下检测吸光度值A2；
[0032](4)按照
△
A＝A2
‑
A1来计算吸光度变化值ΔA，并根据ΔA计算出样本中CTX含量。
[0033]作为本专利技术的优选方式之一，通过将ΔA代入“吸光度本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
1.一种胶乳增强免疫比浊法测定CTX的试剂盒，其特征在于，包括试剂R1和试剂R2；所述试剂R1包括：R1缓冲液5～20mmol/L，稳定剂8～10g/L，防腐剂1～1.5g/L，增敏剂15～25g/L；所述试剂R2包括：R2缓冲液50～100mmol/L，表面活性剂0.05～1g/L，稳定剂6～8g/L，CTX抗体10～20mg/L，100～150nm乳胶微球颗粒5～10ml/L，160～200nm乳胶微球颗粒5～10ml/L，防腐剂1～1.5g/L，活化缓冲液50～100mmol/L，偶联缓冲液20～100mmol/L。2.根据权利要求1所述的胶乳增强免疫比浊法测定CTX的试剂盒，其特征在于，所述R1缓冲液、R2缓冲液、活化缓冲液与偶联缓冲液分别为硼酸缓冲液、硼酸钠缓冲液、甘氨酸缓冲液、磷酸盐缓冲液、Hepes缓冲液、Tris
‑
HCl缓冲液中的一种。3.根据权利要求1所述的胶乳增强免疫比浊法测定CTX的试剂盒，其特征在于，所述稳定剂为蔗糖、乙二胺四乙酸二钠、海藻糖、甘油、明胶、小牛血清白蛋白、酪蛋白中的至少一种。4.根据权利要求1所述的胶乳增强免疫比浊法测定CTX的试剂盒，其特征在于，所述防腐剂为叠氮化钠、庆大霉素、硫柳汞、Proclin300、异噻唑啉酮中的至少一种。5.根据权利要求1所述的胶乳增强免疫比浊法测定CTX的试剂盒，其特征在于，所述增敏剂为聚乙二醇6000、氟化钠中的至少一种。6.根据权利要求1所述的胶乳增强免疫比浊法测定CTX的试剂盒，其特征在于，所述表面活性剂为吐温
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20，曲拉通X
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100，丙三醇中的至少一种。7.根据权利要求1所述的胶乳增强免疫比浊法测定CTX的试剂盒，其特征在于，所述CTX抗体为人I型胶原C末端肽单克隆抗体、大鼠I型胶原C末端肽单克隆抗体中的至少一种，或者是，人I型胶原C末端肽多克隆抗体、大鼠I型胶原C末端肽多克隆抗体中的至少一种。8.根据权利要求1所述的胶乳增强免疫比浊法测定CTX的试剂盒，其特征在于，所...
【专利技术属性】
技术研发人员：芮双印，胡杨，
申请(专利权)人：安徽大千生物工程有限公司，
类型：发明
国别省市：
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