本发明专利技术的目的在于提供一种新型限制增殖型腺病毒及含有其的癌细胞的检测用或癌的诊断用试剂。本发明专利技术提供一种依次含有人端粒酶逆转录酶(hTERT)启动子、E1A基因、IRES序列及E1B基因、且含有第一miRNA的靶序列的多核苷酸。还提供一种在腺病毒基因组的E1区域中组入有含有所述多核苷酸的复制盒而成的重组腺病毒。
【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】【专利摘要】本专利技术的目的在于提供一种新型限制增殖型腺病毒及含有其的癌细胞的检测用或癌的诊断用试剂。本专利技术提供一种依次含有人端粒酶逆转录酶(hTERT)启动子、E1A基因、IRES序列及E1B基因、且含有第一miRNA的靶序列的多核苷酸。还提供一种在腺病毒基因组的E1区域中组入有含有所述多核苷酸的复制盒而成的重组腺病毒。【专利说明】限制增殖型腺病毒
本专利技术涉及一种新型限制增殖型腺病毒及含有其的癌细胞的检测用试剂或癌的诊断用试剂。
技术介绍
目前，作为癌的诊断方法，主要使用(i)使用MRI等大型检查设备的方法和(ii)测定血液中的肿瘤标记等的方法，简便且患者负担较少的方法(ii)备受期待。特别是从在癌患者的外周血液中循环的癌细胞(循环肿瘤细胞(Circulating Tumor Cells:CTC))显示与提高全身转移的危险性及确认到CTC的患者的预后显著低等临床症状密切的关系的方面考虑，期待开发一种简便且高灵敏度地检测作为预后的预测因子或替代标记的CTC的方法。作为检测CTC的方法，使用以EpCAM (上皮细胞粘附分子)或细胞角蛋白_8等癌相关抗原检测的方法(细胞检验系统等)及RT-PCR等检测方法。但是，由于这些癌相关抗原即使在正常的上皮细胞中也会表达，因此，检测出假阳性的可能性较高，另外，从在PCR法中在癌细胞中无法同时观察特征性的细胞形态等、灵敏度及简便性、准确性、成本的观点考虑，寻求新的方法。另一方面，本专利技术人以前开发了一种癌细胞特异性地增殖且表达GFP的限制增殖型腺病毒(GFP-表达限制增殖型病毒(GFP-expressing Conditionally ReplicatingAdenovirus):GFP-CRAd)(称为 TelomeScan (注册商标)、0BP_401 或 Telomelysin-GFP)(专利文献1:W02006/036004)。而且，开发了一种使用该TelomeScan的简便地检测CTC的方法(非专利文献 1:Kojima T., et al’J.Clin.1nvest.，119; 3172，2009)。然而，TelomeScan具有5型腺病毒的纤毛蛋白(7 r 4 一夕、y )'夕質，fiberprotein),经由祀细胞的柯萨奇病毒和腺病毒受体(Coxsackievirus and adenovirusreceptor, CAR)感染，因此,有可能`不会感染未表达CAR的细胞。特别是已知渗透、转移及增殖能力较高且恶性度较高的癌细胞的CAR的表达降低(非专利文献2 =Okegawa T.，etal, Cancer Res., 61:6592-6600, 2001),但TelomeScan有可能无法检测这些恶性度较高的癌细胞。另外，虽然可能性较低，但TelomeScan感染正常的血液细胞(例如白血球)而增殖，表达GFP，由此也认为会产生假阳性。因此，寻求检测包括CAR阴性的几乎全部的癌细胞，且在正常的血液细胞中不会产生假阳性的癌细胞的检测用试剂及癌的诊断用试剂。现有技术文献专利文献专利文献1:TO2006/036004非专利文献I =Kojima T.，et al, J.Clin.1nvest.，119:3172, 2009非专利文献2:Okegawa T., et al, Cancer Res., 61:6592-6600, 2001
技术实现思路
专利技术要解决的问题本专利技术鉴于这样的状况进行，其所要解决的问题在于，提供一种检测出包括CAR阴性细胞的几乎全部的癌细胞，且在血液细胞中不产生假阳性癌细胞的检测用试剂及癌的诊断用试剂，以及提供一种作为这样的试剂有用的限制增殖型重组腺病毒。解决问题的方法本专利技术人等为了解决上述问题进行了潜心研究，结果发现，通过将TelomeScan中的5型腺病毒的纤毛置换为与在几乎全部的人细胞、特别是全部癌细胞中高表达的与CD46结合的腺病毒的纤毛，不仅可以检测CAR阳性细胞，而且可以检测CAR阴性细胞。另外，通过在TelomeScan中组入利用微RNA(miRNA)的基因控制系统，成功地做到在血液细胞中不会产生假阳性，以至完成了本专利技术。即，本专利技术如下所述。(I) 一种多核苷酸，其依次含有人端粒酶逆转录酶启动子、ElA基因、IRES序列及ElB基因，并且含有第一微RNA的靶序列。(2)如上述(I)所述的多核苷酸，其中，第一微RNA在非癌细胞中表达。(3)如上述⑴或⑵所述的多核苷酸，其中，第一微RNA为选自由miR-142、miR-15、miR-16、miR-21、miR-126、miR-181、miR-223、miR-296、miR-125、miR-143、miR-145、miR-199及let_7构成的组中的至少I个。(4) 一种重组腺病毒，其中，在腺病毒基因组的El区域中组入有含有上述(I)~(3)中任一项所述的多核苷酸的复制盒。(5)如上述(4)所述的重组腺病毒，其中，在腺病毒基因组的E3区域中还组入有标记盒，该标记盒含有报告基因及可控制该基因的表达的启动子。(6)如上述(5)所述的重组腺病毒，其中，标记盒还含有第二微RNA的靶序列。(7)如上述(4)所述的重组腺病毒，其中，在腺病毒基因组的E3区域中还组入有细胞死亡诱导盒，该细胞死亡诱导盒含有编码细胞死亡诱导相关蛋白质的基因及可控制该基因的表达的启动子。(8)如上述(7)所述的重组腺病毒，其中，细胞死亡诱导盒还含有第二微RNA的靶序列。(9)如上述(6)或⑶所述的重组腺病毒，其中，第二微RNA在非癌细胞中表达。(10)如上述(9)所述的重组腺病毒，其中，第二微RNA为选自由miR-142、miR-15、miR-16、miR-21、miR-126、miR-181、miR-223、miR-296、miR-125、miR-143、miR-145、miR-199及let-7构成的组中的至·少I个。(11)如上述(5)或(6)所述的重组腺病毒，其中，报告基因为编码发出荧光的蛋白质的基因或编码通过酶反应产生发光物质或者发色物质的酶蛋白质的基因。(12)如上述(5)~(10)中任一项所述的重组腺病毒，其中，所述启动子为人端粒酶逆转录酶启动子或巨细胞病毒启动子。(13)如上述⑷~(12)中任一项所述的重组腺病毒，其还含有编码与⑶46结合的纤毛蛋白的基因。(14)如上述(13)所述的重组腺病毒，其中，与CD46结合的纤毛蛋白含有34型或35型腺病毒的纤毛蛋白的至少纤突结区域(7 r 4 K一 7 7'領域)。(15) 一种癌细胞的检测用试剂，其含有上述⑷~(14)中任一项所述的重组腺病毒。(16) 一种癌的诊断用试剂，其含有上述⑷~(14)中任一项所述的重组腺病毒。(17)如上述(15)所述的试剂，其中，癌细胞是源自从受试者中采集的生物试样的癌细胞。(18)如上述(17)所述的试剂，其中，生物试样为血液。(19)如上述(15)或(18)所述的试剂，其中，癌细胞为循环肿瘤细胞。(20)如上述(15)及(17)~(19)中任一项所述的试剂，其中，癌细胞为耐药性癌细胞。(21)如上述(15)及(17)~(20)中任一项所述的试剂，其中，癌细胞为癌干细胞。(22)如上述(15)及(17)~(本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种多核苷酸，其依次含有人端粒酶逆转录酶启动子、E1A基因、IRES序列及E1B基因，并且含有第一微RNA的靶序列。
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...
【专利技术属性】
技术研发人员：水口裕之，樱井文教，
申请(专利权)人：独立行政法人医药基盘研究所，
类型：发明
国别省市：日本;JP
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