本发明专利技术涉及基因工程领域，具体地，本发明专利技术涉及一种pH?2.5～6.5范围内有高活性的β-甘露聚糖酶MAN5A及其基因和应用。本发明专利技术提供了一种新的β-甘露聚糖酶MAN5A，其具有如SEQ?ID?NO.1或2所示氨基酸序列，且本发明专利技术还提供了编码上述β-甘露聚糖酶MAN5A的基因，其核苷酸序列如SEQ?ID?NO.3或4所示，以及包含该基因的重组载体和重组菌株及其应用。本发明专利技术提供的pH?2.5～6.5范围内有高活性的β-甘露聚糖酶MAN5A具有强嗜酸性，作用pH范围广，较好的耐热性和抗蛋白酶能力，可作应用于饲料、食品、医药等工业。根据本发明专利技术的技术方案可以实现利用基因工程手段生产性质优良适合工业应用的β-甘露聚糖酶。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及基因工程领域，具体地，本专利技术涉及一种pH 2. 5 6. 5范围内有高活性的P -甘露聚糖酶MAN5A及其基因和应用。
技术介绍
植物细胞壁主要由纤维素、半纤维素及木质素等物质构成。甘露聚糖是植物半纤维素的重要组分，是由P-l，4-D-甘露糖连接而成的线状多聚体，在多糖的侧链上主要有葡萄糖基、乙酰基和半乳糖基等取代基团。甘露聚糖具有高亲水性，在单胃动物的消化道内大量吸水，增加了消化道内容物的黏度，抵抗胃肠蠕动，直接影响动物对营养物质的消化吸 收。^ -甘露聚糖酶-mannanase EC3. 2. I. 78)是一种水解甘露聚糖的内切水解酶，以内切方式降解甘露糖主链￠-1,4糖苷键，释放出短的￠-1,4甘露寡糖。虽然甘露聚糖的完全酶解需要P -甘露聚糖酶、^ -甘露糖苷酶、P -葡糖苷酶、a-半乳糖苷酶和脱乙酰酶的协同作用，但其中￠-甘露聚糖酶是主要发挥作用的酶，在饲料中得到比较广泛的应用。在饲料中加入3 -甘露聚糖酶能分解3 -甘露聚糖，使之转化为甘露低聚糖，从而降低 甘露聚糖的抗营养作用，提高饲料利用率，促进畜禽生长，减轻环境污染。另外，￠-甘露聚糖酶分解3 -D-甘露聚糖生成的甘露低聚糖还是一类重要的功能性寡糖，具有一定的免疫原性，能刺激机体的免疫应答，并与病毒和毒素结合，减缓抗原的吸收，能调节肠道菌群，干扰病原菌定植，促进肠道有益菌群增殖，提高动物的生产性能，长期使用可防止沙门菌和肉毒杆菌等致病菌感染及在肠道的定植和繁殖，减少抗生素的添加量。近年来，随着豆类产品(豆柏等)在动物饲料中的广泛应用，甘露聚糖的抗营养作用也越来越受到重视，在饲料中添加酶制剂是解决这一问题的主要途径。近年来，随着甘露寡糖生理功能的发现，绿色饲料的兴起以及人们环保意识的增强，对￠-甘露聚糖酶的研究和利用已进入了一个新的阶段。￠-甘露聚糖酶已被广泛应用于食品、医药、饲料、造纸、纺织印染、石油开采、精细化工及生物技术等诸多领域，是一种新型的工业酶，具有很大的潜在应用价值。而在饲料中应用的甘露聚糖酶，主要在单胃动物的胃和小肠内发挥作用，因此饲料中使用的P -甘露聚糖酶需要具备以下特征第一、最适PH在酸性，同时在整个酸性和中性的pH范围内又能维持较高活性，确保其可以更好的在动物肠道内发挥作用；第二、对动物胃、胰蛋白酶具有较好的抗性，确保其在动物肠道内可以稳定的存在，而不被蛋白酶降解；第三、良好的热稳定性，同时在常温下又具有高活性等综合性质，确保其在制粒加工的过程中不容易失活，而在动物体温39°C左右能够很好的发挥作用；最后，容易发酵生产，成本低廉。因为饲料用酶仅是众多饲料添加剂中的一类，决定了其添加成本必须十分低廉。￠-甘露聚糖酶广泛存在于细菌、放线菌、真菌、植物、动物等生物中。细菌来源的甘露聚糖酶主要是酸偏中性的甘露聚糖酶。其分子量多在35 55kDa之间，最适反应作用温度为50 70°C。目前研究最多的是芽孢杆菌，除嗜碱性芽孢杆菌的最适作用PH达到9. 0以上，大多最适反应pH在5. 5 8.0之间。真菌的￠-甘露聚糖酶一般呈酸性，分子量大约在45 55kDa，最适作用pH为4. 0 6. 0，最适作用温度为55 75°C。相对细菌而言，真菌来源的P -甘露聚糖酶最适反应pH值、pH稳定性都偏低,耐热性比细菌差。目前国内夕卜，虽然许多3 -甘露聚糖酶被克隆分离及性质测定，但这些酶的性质特征，均存在一些缺陷，例如，PH作用范围不合适，热稳定性差，表达量低等，均不能满足实际应用的需要。因此人们希望能够找到一种新的能够满足实际应用需求的3 -甘露聚糖酶，从而能够进一步推广该￠-甘露聚糖酶在饲料、食品、医药等行业中应用。本专利技术从云南锡矿的酸性废水中分离的Penicillium sp. WNl菌株中得到了一个新的￠-甘露聚糖酶基因，其编码的甘露聚糖酶具有以下几个优点宽的PH作用范围良好的热稳定性、高比活、强的蛋白酶抗性、容易发酵生产。所有这些优点都意味着本专利技术的新的甘露聚糖酶在饲料、食品、医药等行业中，与现有￠-甘露聚糖酶相比，将会更有应用价值
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种pH 2.5 6.5范围内有高活性的￠-甘露聚糖酶MAN5A。本专利技术的另一目的是提供编码上述￠-甘露聚糖酶的基因。本专利技术的另一目的是提供包含上述￠-甘露聚糖酶基因的重组载体。本专利技术的另一目的是提供包含上述￠-甘露聚糖酶基因的重组菌株。本专利技术的另一目的是提供制备上述￠-甘露聚糖酶的方法。本专利技术的另一目的是提供上述￠-甘露聚糖酶的应用。本专利技术首先所要解决的技术问题是克服现有技术的不足，提供一种性质优良的适合于在饲料、食品、医药等行业中应用的新的￠-甘露聚糖酶。本专利技术分离筛选出一种生产上述pH 2. 5 6.5范围内有高活性的￠-甘露聚糖酶MAN5A的嗜酸真菌青霉WNKPenicillium sp.)，于2011年8月11日保存于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(北京市朝阳区北辰西路I号院3号，中国科学院微生物研究所，100101)，其保藏号为CGMCC No. 5131。本专利技术提供了一种P -甘露聚糖酶MAN5A，其氨基酸序列如SEQ ID NO. I MKSAILILPF LSHLAVSQTA NWGQCGGENW NGDTTCNPGffYCSYLNPffYS QCVPGSGSSS60SSTTLSTVVS SQTSSIRTTS ATSTLAASAS TTAGSLPSAS GTSFVIDGKKGYFAGTNSYff120LPFLTNNADV DLVMGHLQQS GLKILRVffGF NDVNAVPSSDTVffFQLLANG QQTINTGSDG 180LQRLDYVVKS AEAHGIKLII NFVNNWDDFG GMNAYVQNYGGNQTSffYTNN AAQDAYKTYI240KTVISRYIGS SAIFAffELAN EPRCKGCGTD VIYNWAQSTS QYIKSLEPGRMVCI ⑶ EGMG300LSVDSDGSYP FGYSEGNDFE KTLAIPTIDF GTIHLYPSQff GETDSffGSSffITAHGQACKN360AGKPCLLEEY GSTSLCSSEA PffQTTAISSV AADLFffQffGD TLSTGQSAHDEYSIFYGS SD420YTCLVTDHVS AIDSA435其中，该酶全长435个氨基酸，N端20个氨基酸为其预测的信号肽序列“MKSAILILPF LSHLAVSQTA”。因此，成熟的P -甘露聚糖酶MAN5A的理论分子量为44. 7kDa，其氨基酸序列如SEQ ID NO. 2 ·NWGQCGGENW NGDTTCNPGff YCSYLNPffYS QCVPGSGSSSSSTTLSTVVS SQTSSIRTTS 60ATSTLAASAS TTAGSLPSAS GTSFVIDGKK GYFAGTNSYff LPFLTNNADVDLVMGHLQQS120GLKILRVffGF NDVNAVPSSD TVffFQLLANG QQTINTGSDGLQRLDYVVKS AEAHGIKLII 180NFVNNWDDFG GMNAYVQNYG GNQTSffYT本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种pH?2.5～6.5范围内有高活性的β?甘露聚糖酶MAN5A，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ?ID?NO.1或SEQ?ID?NO.2所示。
【技术特征摘要】
1.一种pH 2. 5 6. 5范围内有高活性的￠-甘露聚糖酶MAN5A，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID NO. I或SEQ ID NO. 2所示。2.—种pH 2. 5 6. 5范围内有高活性的￠-甘露聚糖酶基因man5A，其特征在于，编码权利要求I所述的P -甘露聚糖酶MAN5A。3.根据权利要求2所述的pH2. 5 6. 5范围内有高活性的P -甘露聚糖酶基因man5A，其特征在于，所述基因的核苷酸序列如SEQ ID NO. 3或4所示。4.包含权利要求2或3所述P-甘露聚糖酶基因man5A的重组载体。5.根据权利要求4所述的重组载体，其特征在于，所述重组载体为pPIC9-man5A。6....
【专利技术属性】
技术研发人员：张王照，邵娜，张健康，朱世琴，董玲丽，姜小伟，
申请(专利权)人：北京卫诺恩生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：
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