本发明专利技术涉及基因工程领域，具体地，本发明专利技术涉及一种酸性β-葡聚糖酶P-Bglu16A及其基因和应用。本发明专利技术提供了一种新的酸性β-葡聚糖酶P-Bglu16A，其具有如SEQID?NO.1或2所示氨基酸序列，且本发明专利技术还提供了编码上述酸性β-葡聚糖酶P-Bglu16A的基因，其核苷酸序列如SEQ?ID?NO.3、4或5所示，以及包含该基因的重组载体和重组菌株及其应用。本发明专利技术提供的酸性β-葡聚糖酶P-Bglu16A作用pH范围广(pH3.5-6.0)，最适pH5.0，最适温度50-55℃，在酸性条件下具有良好的稳定性和耐热性，可应用于饲料、酿造、酿酒、烘培等工业。根据本发明专利技术的技术方案可以实现利用基因工程手段生产β-葡聚糖酶。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及基因工程领域，具体地，本专利技术涉及一种酸性P -葡聚糖酶P-Bglul6A及其基因和应用。
技术介绍
￠-葡聚糖是谷物类植物细胞壁的主要成分，在大麦、燕麦、小麦、水稻胚乳细胞壁中含量尤为丰富(Buliga et al. Carbohydr Res 1986,157:139-156)。3 -葡聚糖是由1200个以上吡喃型D-葡萄糖残基以￠-1,4和1，3-糖苷键连接形成线型分子。￠-葡聚糖独特的分子结构使其能以高分子量的形式溶于水，且溶液粘度很高，给工业生产带来诸多不便。如￠-葡聚糖在消化道中吸水膨胀黏连，使其成为限制麦类饲料营养成分有效利用的主要抗营养因子。高分子量的大麦￠-葡聚糖可引起麦汁和啤酒粘度增加，致使麦汁过滤困难、得率降低，啤酒非生物性浑浊，影响啤酒的稳定性和质量。^ -葡聚糖酶可以将P -葡聚糖水解成为较小的聚合物，消除P -葡聚糖造成的负面影响，是饲料工业和啤酒行业中广泛使用的一种酶。根据酶作用底物糖苷键的类型和机制，可将￠-葡聚糖酶分为0-1，3 (4)-葡聚 糖酶(EC 3.2. 1.6)、￠-1,4-葡聚糖酶(纤维素酶，EC 3. 2. 1.4), 3-1，3-葡聚糖酶(昆布多糖酶，EC 3. 2. I. 39), 3-1，3-1，4-葡聚糖酶(地衣多糖酶，EC 3. 2. I. 73)等(McCarthy et al. Int J Biol Macromol. 2003,33 141-148 ；Boyce and Walsh. Appl Microbiol Biotechnol. 2007, 76 :835-8412007)。￠-葡聚糖酶广泛的存在于植物和微生物中。微生物￠-葡聚糖酶因其具有活力高、成本低、来源稳定、提取方便等优点而成为3 -葡聚糖酶的重要来源。现在人们主要从细菌如枯草芽孢杆菌或真菌如黑曲霉、木霉等微生物中提取3 -葡聚糖酶，而天然菌株产葡聚糖酶的量较低是限制其工业化生产的一个重要因素。1983年爱尔兰学者首先从枯草芽抱杆菌中克隆到葡聚糖酶基因(Cantwell and McConnell, gene. 198323(2)211-219)。随后，人们从许多微生物中克隆得到了 ￠-葡聚糖酶基因，并进行序列分析和异源表达。根据氨基酸序列的相似性，0-葡聚糖酶多属于糖苷水解酶第1、5、7、9、12、16和45家族。第16家族的P -葡聚糖酶多来源于细菌，而真菌16家族P -葡聚糖酶则报道的很少。^ -葡聚糖酶是最早的应用于饲料工业的酶类，主要来自芽孢杆菌的16家族 葡聚糖酶，其作用PH为中性限制了其在饲料中的应用效果。饲料用￠-葡聚糖酶的作用环境是动物的胃肠道，单胃动物的胃呈酸性，PH值在2. 0 3. 5。这就要求优良的饲料用^ -葡聚糖酶的最适pH为酸性，而且在pH2. 0到6. 5这一范围内均能维持高活性，这样酶的作用时间最长，能最高地发挥其效率。另外，动物胃肠道中分泌胃蛋白酶、胰蛋白酶等多种蛋白酶以消化食物，￠-葡聚糖酶本身就是一种蛋白质，也有可能被这些蛋白酶降解而失去活性，这就要求饲料用￠-葡聚糖酶必需对动物胃肠道中的蛋白酶有一定的抗性。挖掘分离酸性、高比活、抗蛋白酶的性质优良的葡聚糖酶和葡聚糖酶基因，并实现葡聚糖酶的高效表达，仍然是提高3 -葡聚糖酶饲用效果、提高产量、降低生产成本的关键。本专利技术从云南锡矿的酸性废水中分离的Penicillium sp. WNl菌株中得到了一个新的￠-葡聚糖酶基因，编码的￠-葡聚糖酶具有在酸性及偏中性的PH范围有高活性及稳定性、高比活、强的蛋白酶抗性、良好的热稳定性、容易发酵生产等特点。所有这些优点都意味着本专利技术的新的￠-葡聚糖酶在饲料及食品等行业，与现有￠-葡聚糖酶相比，将会更有应用价值。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种酸性P -葡聚糖酶P_Bglul6A。本专利技术的另一目的是提供编码上述酸性￠-葡聚糖酶的基因。本专利技术的另一目的是提供包含上述酸性￠-葡聚糖酶基因的重组载体。 本专利技术的另一目的是提供包含上述酸性￠-葡聚糖酶的重组菌株。本专利技术的另一目的是提供制备上述酸性￠-葡聚糖酶的方法。本专利技术的另一目的是提供上述酸性￠-葡聚糖酶的应用。本专利技术分离筛选出一种生产上述酸性￠ -葡聚糖酶P_Bglul6A的青霉WNKPenicillium sp.)，于2011年8月11日保存于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(北京市朝阳区北辰西路I号院3号，中国科学院微生物研究所，100101)，其保藏号为CGMCC No. 5131。本专利技术提供了一种P -葡聚糖酶P_Bglul6A，其氨基酸序列如SEQ ID NO. I所示RPSTLLQLA ALAGLSSAQT YTLYDDYPTG MDFFSKFSFFTVffVLFRDTD PTNGYVDYVN 60ENTAESAGLI YASGNATYVG VDSSNVASGS GRQSVRLTST ASYTHGLFVLDLAHMPGSVC120GSffPAFffTVG SNWPNNGEID IIEGVNQQSA NAMTLHTSEG CTINDSGFSGSLSTSNCffTE180APGQSNNAGC GIDATSSATY ⑶GFNSAGGG IYAMEWTCDY IQVFEFTHDSAPADLTSGSP240NPSTffGEPAA YFA⑶CDIDS HFTANQIVFD ITFCGDffAGN VffSSGTCSSLASTCNDYVQN300NPSAFSETYff LINSLKVYSS 320其中，该酶全长320个氨基酸和一个终止密码子，N端18个氨基酸为其预测的信号肽序列 “MRPSTLLQLA ALAGLSSA”。因此，成熟的0 -葡聚糖酶P_Bglul6A的理论分子量为32. 4kDa，其氨基酸序列如SEQ ID NO. 2 QTYTLYDDYP TGMDFFSKFS FFTVffVLFRD TDPTNGYVDYVNENTAESAG LIYASGNATY 60VGVDSSNVAS GSGRQSVRLT STASYTHGLF VLDLAHMPGSVCGSffPAFffT VGSNWPNNGE 120IDIIEGVNQQ SANAMTLHTS EGCTINDSGF SGSLSTSNCff TEAPGQSNNAGCGIDATSSA180TYGDGFNSAG GGIYAMEWTG DYIQVFEFTH DSAPADLTSG SPNPSTWGEPAAYFAGDCDI240DSHFTANQIV FDITFCGDWA GNVWSSGTCS SLASTCNDYV QNNPSAFSETYWLINSLKVY300SS302该酸性￠-葡聚糖酶P_Bglul6A作用pH范围广，低于pH 7. 0时表现出水解活性，最适pH为5.0。在pH 4.0到5.5之间，酶活能达到最高酶活的70%以上，在pH3. 5到6. 0之间，酶活能达到最高酶活的40%以上；该酶最适作用温度50-55°C。这种性质的￠-葡聚糖酶未曾有过报道。·本专利技术提供了编码上述￠-葡聚糖酶的基因p_bglul6A。该酶的全基因序列如SEQID NO. 3 所示atgcgtcctt cgactctcct tcaactggc本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种酸性β?葡聚糖酶P?Bglu16A，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ?ID?NO.1或SEQ?ID?NO.2所示。
【技术特征摘要】
1.一种酸性￠-葡聚糖酶P_Bglul6A，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID NO. I或SEQ ID NO. 2 所示。2.—种酸性￠-葡聚糖酶基因p_bglul6A，其特征在于，编码权利要求I所述的￠-葡聚糖酶 P_Bglul6A。3.根据权利要求2所述的酸性￠-葡聚糖酶基因p-bglul6A，其特征在于，所述基因的核苷酸序列如SEQ ID NO. 3、4或5所示。4.包含权利要求2或3所述酸性P-葡聚糖酶基因p_bglul6A的重组载体。5.根据权利要求4所述的重组载体，其特征在于，所述重组载...
【专利技术属性】
技术研发人员：张健康，张王照，朱世琴，邵娜，姜小伟，董玲丽，
申请(专利权)人：北京卫诺恩生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：
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