本发明专利技术公开了一种耐高温阿拉伯多糖酶及其编码基因和应用，该阿拉伯多糖酶的氨基酸序列如SEQNO：1所示。该阿拉伯多糖酶具有极强的耐热性能和偏中性pH条件下高活性的特性。在75℃、pH为6.5的条件下酶活性最高，比酶活达到16.7U/mg；该蛋白酶在温度为60℃-85℃、pH为6.0-8.0的范围内，均具有较高的酶活，在75℃的反应体系中，保温2h酶活性保持不变。这些特性使得本发明专利技术得到的阿拉伯多糖酶比现有阿拉伯多糖酶具有更大的优越性，适用于75℃以上高温、偏中性pH条件下水果、蔬菜及半纤维素中阿拉伯多糖的降解，具有潜在的工业应用价值。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于基因工程技术及生物质精炼
，具体涉及一种耐高温阿拉伯多糖酶及其编码基因和应用。
技术介绍
阿拉伯多糖是L-阿拉伯糖以α-1，5-糖苷键连接组成的的中性多糖。它们通常聚合度较低(40-50)，辅以α-1,3或少量的α-1，2糖苷键相连的分支结构，能从花生、苹果和甜菜等植物组织中分离获得。阿拉伯多糖酶是半纤维素降解酶系中的一种多糖水解酶，通过随机切阿拉伯多糖的α-1，5-糖苷键，将阿拉伯多糖水解为L-阿拉伯糖。临床研究表明，L-阿拉伯糖对蔗糖的代谢转化具有阻断作用，因此在减肥、控制糖尿病等方面具有重要应用前景。
技术实现思路
专利技术目的针对现有技术中存在的不足，本专利技术的目的是提供一种耐高温阿拉伯多糖酶，以使其满足使用要求。本专利技术的另一目的是提供一种编码上述耐高温阿拉伯多糖酶的核苷酸序列。本专利技术还有一目的是提供上述一种耐高温阿拉伯多糖酶的应用。技术方案为了实现上述专利技术目的，本专利技术采用的技术方案如下 一种耐高温阿拉伯多糖酶，氨基酸序列如SEQ NO 1所示。一种耐高温阿拉伯多糖酶，其特征在于氨基酸序列为权利要求I所述的SEQ NO I序列中的氨基酸经过一个或多个氨基酸残基的取代、缺失及添加形成的具有阿拉伯多糖酶活性的衍生蛋白质。一种编码耐高温阿拉伯多糖酶的基因，DNA序列如SEQ NO 2所示。一种可表达耐高温阿拉伯多糖酶的重组载体，在所述的重组载体上克隆有如SEQNO 2所示的DNA序列。一种可表达耐高温阿拉伯多糖酶的重组菌，在所述的重组菌内克隆有如SEQ Ν02所示的DNA序列。一种扩增编码耐高温阿拉伯多糖酶的基因的方法，所使用的引物对为Tth_l 5’ -GGAATTCCATATGGTATTCAACTGGGCAACTGTACAC-3’ ；Tth-2 :5’ -CCGCTCGAGATCTTCGATCCGAACTCCCCAG-3，。所述的耐高温阿拉伯多糖酶在酶解阿拉伯多糖中的应用。酶解反应温度为60^85°C, pH为6. 0 8· O的反应体系。耐高温阿拉伯多糖酶在降解水果蔬菜和纤维原料中的应用。上述的重组载体或重组菌在酶解阿拉伯多糖中的应用。有益效果与现有技术相比，本专利技术所提供的阿拉伯多糖酶具有极强的耐热性能和偏中性PH条件下高活性的特性。在75°C、pH为6. 5的条件下酶活性最高，比酶活达到16. 7 U/mg ;该蛋白酶在温度为60°C _85°C、pH为6. 0-8. O的范围内，均具有较高的酶活，在750C的反应体系中，保温2h酶活性保持不变。这些特性使得本专利技术得到的阿拉伯多糖酶比现有阿拉伯多糖酶具有更大的优越性，适用于75V以上高温、偏中性pH条件下水果、蔬菜及半纤维素中阿拉伯多糖的降解，具有潜在的工业应用价值。附图说明图I 是 Tth arase 蛋白的 SDS-PAGE 图2是Tth arase蛋白的最适温度结果 图3是Tth arase蛋白的最适pH结果 图4是Tth arase蛋白的热稳定性结果图。具体实施例方式下面结合具体实施例对本专利技术做进一步的说明。实施例I嗜热陆地热泉高温神袍菌基因组DNA的提取 取嗜热陆地热泉高温神袍菌thermarum DSM5069 (购自德国微生物菌种保藏中心)新鲜菌体10g，悬于5mL 50mM Tris缓冲溶液中(pH8. 0)，混匀后，在37°C放置20min，然后加入2mL 10%SDS，55°C放置5min，用等体积的酚-氯仿(24:1)抽提一次，取上清液加入2倍体积的无水乙醇，于_20°C放置30 min, 4°C 13000rpm离心20min，收集沉淀。沉淀溶于 O. 5mL TE 缓冲液(ρΗ8· 0，IOmM Tris, ImM EDTA)，加入 10mg/mL RNase 3μ L,37°C保温lh，用等体积的酚-氯仿(24:1)抽提一次，取上清加入2倍体积的无水乙醇，于_20°C放置30min，4°C 13000 rpm离心20min，收集沉淀，真空冷冻干燥，用O. 5mL超纯水溶解，备用。实施例2阿拉伯糖基因Tth arase的制备 可采用如下方法制备Tth arase基因，也可以采用人工合成的方式得到。认Thermotoga thermarum DSM5069的总DNA (实施例I制备)为模版，用下述引物对进行PCR扩增Tth-I :5’ -GGAATTCCATATGGTATTCAACTGGGCAACTGTACAC-3’ ；Tth-2 :5’ -CCGCTCGAGATCTTCGATCCGAACTCCCCAG-3 ； 在Tth-I引入Nde I酶切位点，在Tth-2引入Xho I酶切位点。PCR 反应体系1 μ L T1. iAerfflara 基因组 DNA, I μ L Tth-1, IuL Tth-2, 25 μ LPremix ExTaq, 22 μ L 超纯水。PCR 反应条件94°C变性 5 min ;94°C变性 30 sec，52°C退火 30 sec，72°C延伸 3min, 30 Cycles ;72°C延伸 IOmin ;4°C保温。PCR产物用1%琼脂糖凝胶电泳检测产量和特异性，并用PCR产物回收试剂盒进行纯化(BI0MIGA，上海)。实施例3重组克隆、表达载体pET-20b-TiA arase的构建与验证 将纯化过的PCR产物(实施例2制备)、pET-20b (Novagen)用分别Nde I和Xho I双酶切，琼脂糖电泳回收酶切酶切PCR及载体大片段。割胶回收后的目的片段与载体，经浓缩加入8μ L无菌水重悬，加入IyL IOXLigase Buffei^PlyL Ligase，于16°C连接过夜。用连接反应产物转化大肠杆菌pET-20b，然后涂于含IOOy g/mL Amp (氨苄青霉素)的培养皿，37°C培养 10-12h。从转化平板上挑取多个单菌落，采用BI0MIGA的质粒小量提取试剂盒提取质粒。对获得的质粒双酶切验证并对获得的重组质粒进行测序。测序结果显示，pET-20b载体中插入了所克隆的目的片段(核苷酸长度为1341bp)，进而得到重组克隆及表达载体pET-20b-7iA arase,Tth arase的核苷酸如SEQ NO :2所示,其编码的氨基酸序列如SEQ NO:I所示，将该蛋白命名为Tth arase。实施例4重组阿拉伯糖Tth arase的表达与纯化 按常规方法将重组克隆、表达载体pET-20b-RA arase电转至宿主菌疋coliBL21(DE3) (Novagen)，获得含有重组质粒的重组菌。将单菌落的重组菌接种于5mL含有100 μ g/ml氨节青霉素的Luria-Bertani broth (LB)培养基,在37°C温度下,200rpm震荡培养8-12h。将上述4mL菌液接种于含400mL培养基的IOOOmL摇瓶中，37°C温度下，200rpm 震荡培养，当吸光度达到O. 6-0. 8时，加人200 μ L的IM IPTG，并在30°C温度下，120rpm诱导表达10-12 h。用高速冷冻离心机将培养液在4°C下，13000rpm离心15min，收集菌体。用50mL超纯水洗漆并在4°C下，以13000 rpm离心15min,本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种耐高温阿拉伯多糖酶，其特征在于：氨基酸序列如SEQ？NO：1所示。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：王飞，时号，李迅，丁怀海，
申请(专利权)人：南京林业大学，
类型：发明
国别省市：
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