本发明专利技术公开了一种β-甘露聚糖酶耐酸性定点改造的方法，其特征是针对一种来源于枯草芽孢杆菌B.subtilis?6-7(CTCCM?2009200)的β-甘露聚糖酶在理性设计的基础上，通过重叠PCR技术进行定点突变，经定点改造后的β-甘露聚糖酶基因与表达载体pMA5连接，转化枯草芽孢杆菌168菌株，成功获得一株β-甘露聚糖酶耐酸性得到显著提高的重组菌株pMA5-gmuGb54/B.subtilis?168，其相对酶活力提高了6.2％，摇瓶水平酶活为3226.23U/mL，最适pH由6.5下降到5.5，此突变酶更利用应用在饲料工业中。
【技术实现步骤摘要】
专利技术涉及ー种β -甘露聚糖酶耐酸性定点改造的方法，属于分子生物学和基因エ程领域。
技术介绍
β -甘露聚糖酶(β -mannanase EC 3. 2. 1. 78)是一种半纤维素水解酶，以内切方式降解β_1，4糖苷键，降解产物的非还原末端为甘露糖，其作用底物包括葡萄甘露聚糖，半乳甘露聚糖及β_甘露聚糖等，β_甘露聚糖酶的来源非常广泛，包括植物、细菌、真菌、放线菌甚至软体动物。 β -甘露聚糖酶可消除食料中甘露聚糖的抗营养作用，改善饲料的营养价值，以及配合其他的酶(木聚糖酶、蛋白酶)进ー步提高家畜的生产性能；作为ー种典型的饲料用酶，其需要满足饲料生产以及动物消化系统对酶的性质的特殊要求，但由于动物肠道对pH的要求在PH2. 0左右，而本项目前期对纯化到的β -甘露聚糖酶酶学性质分析表明，其最适pH为pH6. 5，在pH4. 0以下迅速失活，故为了使其pH特性适合饲料用酶对pH的特殊要求，在理性分析其三维结构的的基础上，对β_甘露聚糖酶进行耐酸性的定点改造，以图得到符合エ业化需要的产β_甘露聚糖酶重组菌株。
技术实现思路
本专利技术主要研究内容针对来源于枯草芽孢杆菌B. subtilis 6-7(已保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CTCCM 2009200)的β -甘露聚糖酶进行理性分析，通过重叠PCR技术进行定点突变，经定点改造后的β -甘露聚糖酶基因Mlu I、BamH I双酶切与经同样酶切的表达载体PMA5在T4连接酶的作用下16°C过夜连接，将连接后的重组质粒转化枯草芽孢杆菌168菌株，成功得到一株重组菌株pMA5_gmuGb54/Bacillus subtilis168，经发酵纯化后对重组蛋白进行酶学性质分析，其pH由pH6. 5下降到pH5. 5，酶活力也相应的提高6.2%。本专利技术的技术方案以重组质粒pMA5_manA作为模板，根据设计好的引物及提前设计好的重叠PCR扩增条件和扩增体系进行定点突变，利用凝胶回收试剂盒对PCR产物进行纯化和回收。用PCR回收产物和质粒pMA5进行双酶切，利用凝胶回收试剂盒回收双酶切产物，利用T4DNA 连接酶 16 °C 过夜连接重组质粒 PMA5-gmuGal76、PMA5_gmuGb54、PMA5_gmuGcl98、PMA5-gmuGdlOU PMA5_gmuGel26，用连接产物转化感受态枯草芽孢杆菌168，挑取阳性转化子到10ml液体LB培养基中，37 °C摇床培养过夜，提取质粒，酶切验证正确后加入甘油，-20°C保藏备用，S卩成功构建了基因工程菌PMA5-gmuGal76/Bacillus subtilis168、 PMA5-gmuGb54/Baci1lus subtilis 168、 PMA5-gmuGc198/Bacillus subtilis 168、PMA5-gmuGdlO 1/Baci 1 lus subtilis 168、PMA5-gmuGe 126/Bacillus subtilis 168。将冻管保藏的基因工程菌分别按1%的接种量转接到10ml液体LB培养基中，37°C摇床培养过夜。次日按2%的接种量转接至50ml液体LB培养基中37°C摇床培养。发酵完成后，将发酵液4°C 8000r/min离心5min后弃上沉淀,将上清通过亲和层析得到纯酶液；分别对纯酶液进行酶学性质的分析，结果表明来自重组菌株PMA5_gmuGb54/Bacillus subtilis 168的β-甘露聚糖酶其最适pH值有ρΗ6. 5下降到ρΗ5. 5，酶活力升高6.2%。说明对β-甘露聚糖酶耐酸性定点改造成功。本专利技术的有益效果作为ー种典型的饲料用酶，其需要满足饲料生产以及动物消化系统对酶的性质的特殊要求，但由于动物肠道对pH的要求，为了使甘露聚糖酶更加适合エ业化生产的需要，本专利技术在理性分析其三维结构的的基础上，对β_甘露聚糖酶进行耐酸性的定点改造，成功构建了ー株产甘露聚糖酶基因工程菌PMA5-gmuGb54/Bacillus subtilisl68，其最适pH值有ρΗ6· 5下降到ρΗ5· 5，酶活力升高6· 2%，并研究了相应的酶学性质的变化，以便为酶的应用提供实验数据。附图说明图1 重叠 PCR 核酸电泳图 M DL 2000marker 叫、a2, t^、b2, c2, c^、d2, e2 为重叠PCR产物。图2亲和层析Ni-NTA柱纯化得到纯酶SDS-PAGE电泳图。M Protein Marker ；1 gmuGal7 ；2 gmuGb54 ；3 gmuGcl98 ；4 gmuGdl01 ；5 gmuGel26 ；6 :突变前 β-甘露聚糖酶MANA2a图3突变前后β -甘露聚糖酶最适pH值比较。 图4重组菌株发酵产β_甘露聚糖酶的生长曲线及酶活曲线。具体实施例方式实施例1 : β -甘露聚糖酶基因的定点突变(1)引物的设计，针对甘露聚糖酶MANA2a在理性分析的基础上，通过重叠PCR技术进行定点突变，利用DNAMAN软件设计引物如下。P1 :5’ -GACGGATCCATGTTTAAGAAACATACGAT-3> (BamH I)P2 :5’ -GGCACGCGTTCAGTGGTGGTGGTGGTGGTGCTCAACGATTGGCGTTA-3’ (Mlu I)MnF3 :5’ -ATGCCATGCTCAGCGAAATTGC-3’MnR4 :5’ ~CAATTTCGCTGAGCATGG~3，MnF5 5，~ACTGGCTTGCGGACCTGCCGAAC~3’MnR6 :5’ ~TTCGGCAGGTCCGCAAGCCAG~3，MnF7 :5’ ~CTGCATGACATGAACGGCGAATG~3，MnR8 :5’ ~CCATTCGCCGTTCATGTCATGC~3，MnF9 :5’ ~CGATTATGCCGCGGGATGG~3，MnRlO :5’ ~CAAGCCATCCCGCGGCATAATCGC~3，MnFll :5’ ~GATCAGTATAAGCAAATACTAG~3，MnR12 :5’ ~GTATTTGCTTATACTGATC~3，(2)以pMA5_manA2a为模板，利用实施例1提供的引物做PCR扩增，扩增条件为94°C，2min，1 个循环；94 °C，30s，56 °C，40s，72 °C，lmin 30s, 25 个循环；72°C，lOmin，1 个循环；15°C，10min，l个循环。扩增体系ddH20 17 μ 1，模板2 μ 1、相应的引物各0. 5 μ 1，dNTP Mix 2 μ 1, extaq-buffer 2. 5 μ 1，ex-Taq 酶 0. 5 μ 1，扩增出含相应的突变位点的PCR 产物 gmuGal76(AAA — GAA) ；2 gmuGb54(CAC — GAC) ；3 gmuGcl98 (GAA — GAC) ；4 gmuGdlOl (AGA — GCG) ；5 gmuGel26 (AAA — GCA)；。利用琼脂糖凝胶回收盒对目的基因进行回收，第一次重叠PCR琼脂糖凝胶电泳如图1所示。实施例2 :重组质粒的构建及转化Bacillus subtilis 168构建重组载体PMA5-本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种β?甘露聚糖酶耐酸性定点改造，其特征是根据β?甘露聚糖酶三级结构分析，通过重叠PCR技术进行定点突变，经过定点改造将第54位的组氨酸突变为天冬氨酸后的β?甘露聚糖酶基因连接至表达载体pMA5上，将连接后的重组质粒转化枯草芽孢杆菌168菌株，成功得到一株重组菌株pMA5?gmuGb54/Bacillus?subtilis?168。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：饶志明，徐美娟，张显，刘项羽，
申请(专利权)人：江南大学，
类型：发明
国别省市：
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