一种大菱鲆C型溶菌酶及其构建和应用制造技术

本发明专利技术涉及分子微生物学领域，具体的说是一种大菱鲆C型溶菌酶及其构建和应用。溶菌酶为序列表SEQ?ID?No.1中的氨基酸序列所示。具体为：以大菱鲆cDNA为模板PCR扩增溶菌酶基因，将PCR产物与载体pEASY-E2连接，将连接液转化大肠杆菌BL21(DE3)，得转化子BL21/pSmLysC，经异丙基-β-D-硫代半乳糖苷诱导后，利用亲和层析柱纯化重组蛋白，即得C型溶菌酶。本发明专利技术的溶菌酶可以有效裂解多种革兰氏阳性菌，因而可以用于防控革兰氏阳性菌相关疾病。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及分子微生物学领域，具体的说是一种大菱鲆C型溶菌酶及其构建和应用。
技术介绍
溶菌酶(lysozyme)，又称为胞壁质酶或N-乙酰胞壁质聚糖水解酶，它能降解细菌细胞壁中N-乙酰胞壁酸和N-乙酰氨基葡糖之间的P -I, 4糖苷键，从而破坏细胞壁，使得胞内容物释放，由此导致细菌死亡。根据其序列结构特点,溶菌酶可分为六大类,其中C型溶菌酶(C-type lysozyme)在动物中是一种主要类群,广泛存在哺乳动物、鸟类、鱼类等。溶菌酶是一种重要的天然免疫因子，在抗病原感染过程中发挥重要作用，因此在临床上，溶菌 酶用于抗细菌和病毒感染以及消肿止痛等。另外，溶菌酶在食品工业中被用作防腐剂。
技术实现思路
本专利技术目的在于提供一种大菱鲆C型溶菌酶及其构建和应用。为实现上述目的，本专利技术采用的技术方案为一种大菱鲆C型溶菌酶，溶菌酶为序列表SEQ ID No. I中的氨基酸序列所示。大菱鲆C型溶菌酶的制备方法，I)菌株 BL21/pSmLysC 的构建以大菱鲆cDNA为模板，用引物Fl和Rl进行PCR扩增，PCR产物纯化后与载体PEASY-E2于室温连接2 — 8小时，连接混合液转化大肠杆菌BL21 (DE3)，筛选转化子，即为 BL21/pSmLysC ;所述 Fl 为 5’ -GATATCATGAAAGTCTTCGAACGCTGT-3’，Rl 为5’ -GATATCCACACCACATCCTGCCAC-3’ ；2)溶菌酶的表达和制备将上述步骤I)的BL21/pSmLysC在含有安卡青霉素的LB培养基上培养至OD6tltl为0. 5，加入异丙基-P -D-硫代半乳糖苷使其终浓度达到lmM，28°C继续摇动培养5 — 6小时，而后用亲和层析柱纯化重组蛋白，即为SEQ IDNo. I中氨基酸序列所示。大菱鲆C型溶菌酶的应用，所述溶菌酶可作为革兰氏阳性菌的抑菌剂。所述革兰氏阳性菌为藤黄微球菌(Micrococcus luteus)、海豚链球菌(Strep tococcus iniae)或金黄色葡萄球菌(Staphyl ococcus aureus)。本专利技术具有如下优点本专利技术的溶菌酶可以有效裂解多种革兰氏阳性菌，因而可以用于防控革兰氏阳性菌相关疾病。附图说明图I为本专利技术实施例纯化得到的溶菌酶电泳图谱(其中，纯化得到的溶菌酶为泳道2 ;泳道I :分子量marker。)。图2为本专利技术实施例溶菌酶的杀菌效应例图(其中，图A为本专利技术实施例制备的溶菌酶产生的抑菌圈；图B为PBS阴性对照)。具体实施例方式下面结合实施例对本专利技术作进一步说明。实施例旨在对本专利技术进行举例描述，而非以任何形式对本专利技术进行限制。在本专利技术实施例中所涉及到的常规性实验方法均采用如下方法I.质粒提取、DNA(PCR)产物纯化、DNA片段从凝胶中回收皆使用“天根生化科技(北京)有限公司”的相应试剂盒。2.大肠杆菌用 Hanahan 方法(Sambrook and Russell :Molecular Cloning: ALaboratory Mannual. Cold Spring Harbor Laboratory Press 2001)；酵母转化按Invitrogen公司的方法(Catalog no. V175-20);聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS — PAGE)按照·Sambrook and Russell:Molecular Cloning:A Laboratory Mannual. Cold Spring HarborLaboratory Press2001o3.所有限制性内切酶和连接酶皆购自于“纽英伦生物技术有限公司”，北京。实施例I本专利技术的溶菌酶为序列表SEQ ID No. I中的氨基酸序列。序列表SEQ ID No. I 为:MRCLLLLLLVPVPGAKVFERCEWARLLKRNGMSNYRGISLADWVCLSQWESSYNTRATNRNTDGSTDYGIFQINSRffffCDNGQTPTSNACGISCSALLTDDVGAAIICAKHVVRDPNGIGAffVAWKRHCQGQDLSSYVAGCGV(a)序列特征 长度143 类型氨基酸序列籲链型单链 拓扑结构线性(b)分子类型蛋白质(C)假设否(d)反义否( e )最初来源大菱鲆空间结构该蛋白含有I个C型溶菌酶结构域，由氨基酸16 - 141构成。实施例2溶菌酶的制备方法I)菌株 BL21/pSmLysC 的构建以大菱鲆cDNA为模板，用引物Fl和Rl进行PCR扩增。PCR条件为94° C60s预变性模板DNA,然后 94° C 40s, 55° C 60s, 72° C 60s, 5 个循环后改为 94° C 40s, 63° C60s, 72° C 60s，25个循环后再在72° C延伸反应7 — lOmin。PCR产物纯化后与载体PEASY-E2 (购于北京全式金生物技术有限公司)于室温连接2 — 8小时，连接混合液转化大肠杆菌BL21(DE 3)(购于天根生化科技(北京)有限公司)，在含安卡青霉素(50ug/ml)、Xga I (40ug/ml)、异丙基-P -D-硫代半乳糖苷(24ug/ml)的LB培养基上培养18 — 24小时，筛选转化子，即为BL21/pSmLysC。所述LB组成成分按重量百分比计1. 0 %蛋白胨，0. 5 %酵母粉，I. 0 %氯化钠，97.5 % 蒸馏水。所述 Fl 为 5’ -GATATCATGAAAGTCTTCGAACGCTGT-3’ ；R1 为5’ -GATATCCACACCACATCCTGCCAC-3’。2)溶菌酶的表达和制备将BL21/pSmLysC在含有卡那霉素的LB培养基中于37°C培养至OD6tltl为0. 5，加入异丙基-P -D-硫代半乳糖苷使其终浓度达到lmM，28°C继续摇动培养5 — 6小时，而后用GE Healthcare (美国)公司的nickel-nitrilotriacetic acid亲和层析柱纯化重组蛋白(层析条件用4 - 5ml洗涤液洗柱两次，随后用0. 5 - Iml洗脱缓冲液洗柱，收集所有洗脱液)。将重组蛋白用聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS — PAGE)分析，发现其分子量与表SEQ IDNo. I中序列的G3BP分子量一致(参见图I)。将重组蛋白进行质谱分析，证实 其与序列表SEQ ID No. I中序列一致。上述洗涤液成分为50mMNaH2PO4, 300mM NaCl, 20mM imidazole, pH8. 0;上述洗脱缓冲液成分为50mM NaH2PO4, 300mM NaCl, 250mM imidazole, pH 8. 0.实施例3溶菌酶的杀菌检测I)细菌平板制备。在LB培养基中培养内分别培养革兰氏阳性菌藤黄微球菌(Micrococcus luteus)、海豚链球菌(Streptococcus inie)(保存于 CGMCC,编号为 CGMCC1984)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)(保存于 CGMCC,编号为 CGMCC I. 363)分别培养至OD6tltl为0. 5，将上述各菌种与含有0. 8% (质量百分比)琼脂的LB混合；将混合液倒入培养皿，本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种大菱鲆C型溶菌酶，其特征在于：溶菌酶为序列表SEQ?I?D?No.1中的氨基酸序列所示。

【技术特征摘要】
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【专利技术属性】
技术研发人员：孙黎，于兰萍，
申请(专利权)人：中国科学院海洋研究所，
类型：发明
国别省市：