一种乙酰木聚糖酯酶及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种新型乙酰木聚糖酯酶的DNA，它的核苷酸序列如SEQAXENO.1所示。它的氨基酸序列如SEQAXENO.2所示。蛋白结构为同源三聚体时活性最高。本发明专利技术还公开了含上述新型乙酰木聚糖酯酶DNA的克隆载体和克隆技术，及重组酯酶对短链脂肪酸脂及酰基糖类的水解应用及其在生产β-内酰胺类抗生素的重要中间体-去酰基化的7-氨基头孢烷酸及去酰基化头孢菌素C中的应用，具有重要的工业应用价值。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于基因工程
，具体涉及一种从枯草芽孢杆菌OfeciJAz1S 中获得的新型酯酶及表达载体、重组酯酶及重组酯酶在水解短链脂肪酸脂、去酰基化反应及β -内酰胺类抗生素的重要中间体-去酰基化的7-氨基头孢烷酸及去酰基化头孢菌素C中的应用。
技术介绍
乙酰木聚糖酯酶(acetyl xylan esterase,缩写ΑΧΕ)是一类可以将木聚糖或低聚木糖中的酰基化的吡喃木糖去酰基化并释放出醋酸的酯酶，分类于羧酸酯酶家族7，可以水解短链脂肪酸及各种酰基化化合物，具有广泛的底物特异性。 现今，乙酰木聚糖酯酶表现出巨大的科研价值和工业应用价值，主要体现在以下两个方面。一方面，乙酰木聚糖酯酶在半纤维素木聚糖的降解中起重要作用。该酶与内切β-1,4-木聚糖酶、β -D-木糖苷酶、a -L呋喃型阿拉伯糖苷酶及α -葡萄糖醛酸酶一起构成木聚糖降解酶系，能水解具有复杂结构的半纤维素木聚糖，使得开发和利用自然界中取之不尽的可再生资源成为可能，近些年获取高活力的乙酰基木聚糖酯酶及解析此酶的结构和功能已经成为研究的热点。另一方面，乙酰木聚糖酯酶具有良好的酰基酯酶活性，可以催化7-氨基头孢烷酸和头孢菌素C脱酰基合成β -内酰胺类抗生素母核，具有巨大的工业应用价值。β_内酰胺抗生素是抗生素中的最主要类型之一，全世界耗用量过万吨。目前使用的化学法存在成本高、三废污染严重等问题，很多制造领域已愈来愈趋向使用酶法合成。目前已知报道的生产乙酰木聚糖酯酶的芽孢类微生物有pumilus、Bacillus subtil is ATCC6633^ Baci11us subtilisl&S ^BaciIlus halodurans C—125等。其中，除subtil is ATCC6633的乙酰木聚糖酯酶被报道具有较高pNPA酶活力(1580U/mg)外，其他菌株的乙酰木糖酯酶的活力和性能仍然较差，限制了其在半纤维素降解和酶法合成β-内酰胺抗生素中广泛应用。因此，需要开发一种高活性的乙酰木聚糖酯酶，扩大其使用范围。
技术实现思路
本专利技术的技术目的是提供一种新型的乙酰木聚糖酯酶的编码氨基酸序列及其对应的核苷酸序列。本专利技术的第二个技术目的是提供乙酰木聚糖酯酶的蛋白质结构，其中，以同源六聚体的活性最高。本专利技术的第三个技术目的是提供包括乙酰木聚糖酯酶的编码基因的表达载体。本专利技术的第四个技术目的是提供制备重组乙酰木聚糖酯酶的方法。本专利技术的第五个技术目的是提供重组乙酰木聚糖酯酶在水解短链脂肪酸脂、去酰基化反应、生产去酰基化的7-氨基头孢烷酸及去酰基化头孢菌素C中的应用。本专利技术通过以下技术方案来实现本专利技术利用PCR技术从枯草芽孢杆菌基因组DNA中扩增出Cah基因，将Cah基因连在表达载体pET22b多克隆位点处，得到重组质粒pET-Cah，再将重组质粒ρΕΤ-Cah转化E. coli BL21 (DE3)，得到重组的大肠杆菌，即产乙酰木聚糖酯酶的基因工程菌万.coliBL21-pET-Cah。菌株培养后用IPTG诱导表达，产生重组乙酰木聚糖酯酶，对重组乙酰木聚糖酯酶分离即可。详细的操作过程见实施例I和实施例2。按照本专利技术的技术方案，可以达到良好的技术效果 一、本专利技术的乙酰木聚糖酯酶序列与解淀粉芽孢杆菌FZB42 (GenBank: YP001419972. I)的乙酰木聚糖酯酶的序列同源性为99%，有10个碱基、2个氨基酸不同于解淀粉芽孢杆菌FZB42的乙酰基木聚糖酯酶基因氨基酸位置第240位由GCC编码的丙氨酸(A)替换为ACC、或者ACA、或者ACG编码的苏氨酸(T) ;289位氨基酸由GAA编码的谷氨酸(E)替换为CAA、或者CAG编码的谷氨酰胺(Q)。此外，本专利技术的乙酰木聚糖酯酶与已表征的 ifeciBiAs subtil isX^ (GenBank: NP_388200. I )> Bacillus subtil is ATCC6633·(GenBank: ZP_06875135. I ), Bacillus pumilus Cect5072 (GenBank: 2XLC_A)的乙酰木聚糖酯酶同源性分别为84%、84%、73% ;与Thermobacillus composti乙酰木聚糖酯酶(GenBank: ZP_08919340. I)同源性为沿％，与 Thermotoga maritima MSB8 乙酸木糖酯酶(GenBank: NP_227893. I)同源性 41%,与 Bacillus halodurans C-125 的头抱菌素 C 脱氧酶(GenBank: BAB07045. I)同源性 35%。对上述重组乙酰木聚糖酯酶进行了诱导表达，得到了如SEQ ID No 2所示的氨基酸序列。在本专利技术中，该氨基酸序列对应的核苷酸序列如SEQ ID No :1所示。但是，根据本领域技术人员的公知常识可知，可以编码一个氨基酸残基的核苷酸密码子的编码可能有至少一种，或者两种及以上，因此，本专利技术所述乙酰木聚糖酯酶的保护范围应该首先基于SEQID No :2所示的氨基酸序列为准，其扩展保护范围是可以编码出SEQ ID No :2所示的氨基酸序列的任何核苷酸序列，而不限于SEQ ID No :1所示的核苷酸序列所示的序列。二、本专利技术所述的乙酰木聚糖酯酶(AXE)，其蛋白质结构为同源六聚体，可解聚为同源三聚体，且同源三聚体具有一定的活性。本专利技术的重组乙酰木聚糖酯酶单体分子量为36 kDa,而三聚体分子量为107kDa，六聚体分子量为216 kDa。自然状态下乙酰木聚糖酯酶为同源六聚体，在1%的SDS作用下，可以解聚为同源三聚体，无SDS存在时，三聚体迅速自聚合为六聚体，且恢复六聚体的高活性。现有技术报道的subtiIisVi^及短小芽孢杆菌乙酰木聚糖酯酶自然状态下亦为同源六聚体，分子量分别为220 kDa和190 kDa，但其三聚体存在形式未见报道。(Multifunctional Xylooligosaccharide/Cephalosporin C DeacetylaseRevealed by the Hexameric Structure of the Bacillus subtilis Enzyme at I. 9 AResolution. Florence Vincent, Simon J et al. 2003. J. Mol. Biol. (2003) 330,593—606;The crystal structure of the cephalosporin deacetylating enzyme acetylxylan esterase bound to paraoxon explains the low sensitivity of this serinehydrolase to organophosphate inactivation. Silvia Montoro-Garcia, FernandoGil-Ortiz et al. 2011. Biochem. J 436, 321-330)D Bacillus subtilis ATCC6633的乙酸木聚糖酯酶为单聚体，分子量为37 kDa (Yes本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种乙酰木聚糖酯酶，其特征在于其具有SEQ?ID?NO：2所示的氨基酸序列。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：黄和，李霜，田倩倩，宋萍，徐晴，
申请(专利权)人：南京工业大学，
类型：发明
国别省市：