具有果胶乙酰酯酶活性的多肽和编码该多肽的核酸制造技术

本发明专利技术涉及具有果胶乙酰酯酶活性的分离多肽，和编码多肽的分离核酸序列。本发明专利技术还涉及包含核酸序列的核酸构建物、载体、和宿主细胞，以及生成和使用多肽的方法。（*该技术在2020年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

技术介绍
果胶乙酰酯酶催化线性的同型聚半乳糖醛酸(无毛)区羧基处的乙酰基发生脱乙酰作用。鼠李糖半乳糖醛酸聚糖乙酰酯酶催化高度分支的鼠李糖半乳糖醛酸聚糖(有毛)区羟基处的乙酰基发生脱乙酰作用。已经由菊欧文菌(Erwinia chrysanthemi)(Shevchik等人，1997，分子微生物学(Molecular Microbiology)241285-1301)；豇豆(Vigna radiataL)(Breton等人，1996，FEBS通讯(FEBS Letters)388139-142)；和黑曲霉(Aspergillus niger)(Searle-VanLeeuwen等人，1996，生物技术进展(Progress in Biotechnology)，第793-798页)分离了果胶乙酰酯酶。已经由棘孢曲霉(Aspergillus aculeatus)(Kauppinen等人，1995，生物化学杂志(Journal of Biological Chemistry)27027172-27178；WO 93/20190)分离了鼠李糖半乳糖醛酸聚糖乙酰酯酶。已经由菊欧文菌分离了编码果胶乙酰酯酶的基因(Shevchik等人，1997，见上文)。已经由棘孢曲霉分离了编码鼠李糖半乳糖醛酸聚糖乙酰酯酶的基因(Kauppinen等人，1995，见上文)。本专利技术的一个目的是提供具有果胶乙酰酯酶活性的改进多肽和编码该多肽的核酸。专利技术概述本专利技术涉及选自下组的具有果胶乙酰酯酶活性的分离多肽(a)具有与SEQ ID NO2的第26-382位氨基酸具有至少65％同一性的氨基酸序列的多肽；(b)由在低严谨条件下与(i)SEQ ID NO1的第76-1146位核苷酸，(ii)至少100个核苷酸的(i)的亚序列，或(iii)(i)或(ii)的互补链发生杂交的核酸序列编码的多肽；(c)具有SEQ ID NO2的氨基酸序列的多肽包含一个或多个氨基酸的替代、删除、和/或插入的变体；(d)(a)或(b)的等位基因变体；和(e)(a)、(b)、或(d)的具有果胶乙酰酯酶活性的片段。本专利技术还涉及编码多肽的分离核酸序列，包含该核酸序列的核酸构建物、载体、和宿主细胞，以及生成和使用所述多肽的方法。图的简述附图说明图1显示枯草芽孢杆菌168果胶乙酰酯酶的基因组DNA序列和推导氨基酸序列(分别为SEQ ID NO1和2)。图2显示pDG268MCS的限制性图谱。图3显示pHP13amp-MCS的限制性图谱。图4显示pHP13amp-SAV的限制性图谱。图5显示pUC18-PrcryIIIA/cryIIIAstab/cryIIIA的限制性图谱。图6显示pDG268MCS-PrcryIIIA/cryIIIAstab/SAV的限制性图谱。图7显示pDG268MCSΔ-PrcryIIIA/cryIIIAstab/SAV的限制性图谱。图8显示pDG268MCSΔneo-PrcryIIIA/cryIIIAstab/SAV的限制性图谱。图9显示包含“共有”amyQ启动子的核酸序列。图10显示pDG268MCS-Pr“短共有”amyQ/SAV的限制性图谱。图11显示pDG268MCSΔneo-Pr短“共有”amyQ/PrcryIIIA/cryIIIAstab/SAV的限制性图谱。图12显示pCAsub3Δ-Pr“短共有”amyQ/PrcryIIIA/SAV的限制性图谱。专利技术详述具有果胶乙酰酯酶活性的多肽术语“果胶乙酰酯酶活性”在这里定义为催化果胶GalUA残基羟基处的乙酰基发生脱乙酰作用的乙酰酯酶活性。为了本专利技术的目的，使用对硝基苯乙酸酯作为底物来测定果胶乙酰酯酶活性，即将4.5mM对硝基苯乙酸酯(溶于100mM MOPS/4mM CaCl2，pH7.5)与乙酰酯酶一起于25℃保温，并于405nM测量对硝基苯酚离子的释放量，作为时间的函数。1个单位的果胶乙酰酯酶活性定义为于25℃和pH7.5每分钟由对硝基苯乙酸酯产生1.0μmol对硝基苯酚离子。在第一个实施方案中，本专利技术涉及氨基酸序列与SEQ ID NO2的第26-382位氨基酸(即成熟多肽)具有至少大约65％、优选至少大约70％、更优选至少大约80％、甚至更优选至少大约90％、最优选至少大约95％、甚至最优选至少大约97％同一性且具有果胶乙酰酯酶活性的分离多肽(以下称为“同源多肽”)。在一个优选的实施方案中，同源多肽具有因5个氨基酸、优选4个氨基酸、更优选3个氨基酸、甚至更优选2个氨基酸、最优选1个氨基酸而与SEQ ID NO2的第26-382位氨基酸不同的氨基酸序列。为了本专利技术的目的，通过Clustal法(Higgins，1989，CABIOS 5151-153)，使用LASERGENETM MEGALIGNTM软件(DNASTAR公司，Madison，WI)以及同一性表格和如下多重比对参数来测定两种氨基酸序列之间的同一程度缺口罚分10，缺口长度罚分10。成对比对参数是Ktuple＝1，缺口罚分＝3，窗＝5，对角线＝5。本专利技术的多肽优选包含SEQ ID NO2的氨基酸序列或其等位基因变体；或其具有果胶乙酰酯酶活性的片段。在更优选的实施方案中，本专利技术的多肽包含SEQ ID NO2的氨基酸序列。在另一个优选的实施方案中，本专利技术多肽包含SEQ ID NO2的第26-382位氨基酸或其等位基因变体；或其具有果胶乙酰酯酶活性的片段。在另一个优选的实施方案中，本专利技术多肽包含SEQ ID NO2的第26-382位氨基酸。在另一个优选的实施方案中，本专利技术的多肽由SEQ ID NO2的氨基酸序列或其等位基因变体；或其具有果胶乙酰酯酶活性的片段构成。在另一个优选的实施方案中，本专利技术的多肽由SEQ ID NO2的氨基酸序列构成。在另一个优选的实施方案中，多肽由SEQ ID NO2的第26-382位氨基酸或其等位基因变体；或其具有果胶乙酰酯酶活性的片段构成。在另一个优选的实施方案中，多肽由SEQ ID NO2的第26-382位氨基酸构成。SEQ ID NO2的片段是由该氨基酸序列的氨基和/或羧基端删除了一个或多个氨基酸的多肽。片段优选包含至少310个氨基酸残基，更优选至少325个氨基酸残基，最优选至少350个氨基酸残基。等位基因变体指占据相同染色体基因座的基因的任何两种或多种候选形式。等位基因变异通过突变天然产生，而且可在种群内导致多态性。基因突变可以是沉默的(编码的多肽没有变化)，或者可编码具有改变氨基酸序列的多肽。多肽的等位基因变体是由基因的等位基因变体编码的多肽。在第二个实施方案中，本专利技术涉及具有果胶乙酰酯酶活性且由在很低严谨条件、优选低严谨条件、更优选中严谨条件、更优选中-高严谨条件、甚至更优选高严谨条件、最优选很高严谨条件下与核酸探针发生杂交的核酸序列编码的分离多肽，所述核酸探针在相同条件下与(i)SEQ ID NO1的第76-1146位核苷酸，(ii)(i)的亚序列，或(iii)(i)或(ii)的互补链发生杂交(J.Sambrook、E.F.Fritsch、和T.Maniatus，1989，《分子克隆实验室手册》(Molecular Cloning，A Laboratory Manual)，第2版，冷泉港，纽约本文档来自技高网...

【技术保护点】
选自下组的具有果胶乙酰酯酶活性的分离多肽：（ａ）具有与ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２成熟多肽的第２６－３８２位氨基酸具有至少６５％同一性的氨基酸序列的多肽；（ｂ）由在低严谨条件下与（ｉ）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１的第７６－１１４６位核苷酸，（ｉ ｉ）至少１００个核苷酸的（ｉ）的亚序列，或（ｉｉｉ）（ｉ）或（ｉｉ）的互补链发生杂交的核酸序列编码的多肽；（ｃ）具有ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２的氨基酸序列的多肽包含一个或多个氨基酸的替代、删除、和／或插入的变体；（ｄ）（ａ）或（ｂ）的等 位基因变体；和（ｅ）（ａ）、（ｂ）、或（ｄ）的具有果胶乙酰酯酶活性的片段。

【技术特征摘要】
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【专利技术属性】
技术研发人员：MD托马斯，KM布朗，
申请(专利权)人：诺沃奇梅兹生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：US[美国]