纯化的多孔菌属漆酶及编码该酶的核酸制造技术

本发明专利技术涉及带有一段编码多孔菌属（Ｐｌｙｐｏｒｕｓ）漆酶序列的分离的核酸，以及所编码的漆酶蛋白。（*该技术在2015年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及编码一种真菌氧化还原酶的分离核酸片段，以及由该片段所产生的纯化酶。更具体地讲，本专利技术涉及编码一种酚氧化酶，特别是担子菌-多孔菌属的漆酶的核酸片断。漆酶(苯二醇氧氧化还原酶)是含多个铜的酶，它能催化酚类物质的氧化。漆酶对合适酚类底物的氧化作用，会导致芳氧基中间体的产生，所产生的中间体通过最终聚合，形成由二聚、低聚和多聚反应产物组成的混合物。这种反应在导致黑素、生物碱、毒素、木素和腐殖酸形成的生物合途径中实际上起着重要作用。漆酶可由很多种真菌产生，包括子囊菌，如曲霉属(Aspergillus)、脉孢菌属(Neurospora)和柄孢壳菌属(Podospora)，半知菌纲的葡萄孢属(Botrytis)，和担子菌，如金钱属(Collybia)、层孔菌属(Fomes)、香菇属(Lentinus)、侧耳属(Pleurotus)、栓菌属(Trametes)、多孔菌属(Polyporus)和完全丝核菌属(Rhizoctonia)。漆酶具有很大范围的底物专一性，而且，各种不同真菌的漆酶在其氧化酚类底物的能力方面通常仅有量的差别。由于其底物的多样性，漆酶一般具有很多潜在的工业应用前景。其中包括木素改性、纸张强化、洗涤剂中染料转移的抑制、苯酚聚合作用、果汁生产、酚醛树脂的生产、及废水处理。由不同真菌菌种制成的漆酶，虽然催化能力相似，但具有不同的温度和pH最佳值，而且，温度和pH最佳值也会根据具体的底物而有所不同。已经分离得到多种上述真菌漆酶，而且，编码其中几种酶的基因也已被克隆。例如，Choi等(Mol.Plant-Microbe Interactions 5119-128，1992)披露了编码粟树枯萎真菌Cryphonectria parasitica的漆酶的基因的分子特征和克隆。Kojima等(J.Biol.Chem.26515224-15230，1990；JP2-238885)披露了白腐担子菌Coriolus hirsutus漆酶的两种等位形式。Germann和Lerch(Experientia 41801，1985；PNAS USA 838854-8858，1986)报道了对粗糙链孢霉(Neurosporacrassa)漆酶基因的克隆和部分序列分析结果。Saloheimo等(J.Gen.Microbiol.1371537-1544，1985；WO 92/01046)披露了对来自真菌Phlebia radiata的漆酶基因的结构分析结果。所做的在异源真菌系统中表达漆酶基因的尝试，通常获得极低的产率(Kojima等，Supra；Saloheimo等，Bio/Technol.9987-990，1991)。例如，在实验室规模的发酵中，Phlebia radiata漆酶在Trichoderma reesei中进行的异源表达，在每升发酵液中仅有20mg活性酶(Saloheimo，1991，supra)。尽管漆酶具有巨大的商业潜力，但是，能否大量表达这种酶是决定其商业应用前景的关键。以前所做的在重组宿主中表达担子菌漆酶的尝试中，只得到极低的产率。本专利技术要提供在曲霉属中表达良好的新的担子菌漆酶。本专利技术涉及一种DNA结构，该结构带有一段编码一种多孔菌属漆酶的核酸序列。本专利技术还涉及分离到的由上述核酸序列编码的漆酶。这种漆酶最好基本上是纯的。“基本上是纯的”是指一种漆酶中基本上(即≥90％)不含其它非漆酶蛋白。为促进上述新漆酶的生产，本专利技术还提供了带有要求保护的核酸序列的载体和宿主细胞，这种载体和宿主细胞可用于所述漆酶的重组生产。所述核酸序列与转录和翻译信号可操纵地连接，这些信号可指导所述漆酶蛋白在所选择的宿主细胞中表达。优选的宿主细胞是真菌细胞，曲霉属的细胞为最佳宿主细胞。本专利技术漆酶的重组生产是这样实现的在适合漆酶蛋白表达的条件下培养用本专利技术的结构转化或转染的宿主细胞，并从培养物中回收所述漆酶蛋白。本专利技术的漆酶可用于很多需要对酚类物质进行氧化的工业方法中。所述方法包括木素加工、果汁生产、苯酚聚合和酚醛树酯生产。附图说明图1表示带有LCC1(SEQ ID No.1)的基因组克隆21GEN的DNA序列和该序列的翻译。图2表示带有LCC2(SEQ ID No.3)的基因组克隆23GEN的DNA序列和该序列的翻译。图3表示带有LCC3(SEQ ID No.5)的基因组克隆24GEN的DNA序列和该序列的翻译。图4表示带有LCC4(SEQ ID No.7)的基因组克隆31GEN的DNA序列和该序列的翻译。图5表示带有LCC5(SEQ ID No.9)的基因组克隆41GEN的DNA序列和该序列的翻译。图6表示载体pMWR1的结构。图7表示载体pDSY1的结构。图8表示载体pDSY10的结构。图9表示由pDSY2所产生的漆酶的pH曲线；(A)丁香醛连氮氧化作用；(B)ABTS氧化作用。图10表示用漆酶和H2O2分别处理各种用于染发的染料前体的比较，测量DL*。图11表示用漆酶和H2O2分别处理各种用于染发的染料前体的比较，测量Da*。图12表示用漆酶和H2O2分别处理各种用于染发的各种染料前体和改性剂的比较，测量DL*。图13表示分别用漆酶和H2O2染过的头发的洗涤稳定性的比较。图14表示分别用漆酶和H2O2染过的头发的耐晒性。Polyporus pinsitus是一种担子菌，又被称为绒毛样栓菌(Trametesvillosa)。多孔菌早先就已被确认为漆酶生产菌(Fahraeus和Lindeberg，Physiol.Plant.6150-158，1953)。不过，尚未见从Polyporus pinsitus中提纯漆酶的报道。业已证实Polyporus pinsitus能产生至少两种不同的漆酶，而且可将编码这两种酶的基因用于在简便的宿主系统，如曲霉属中以较高的产率生产这种酶。另外，还分离到能编码漆酶的3个其它基因。通过对各种真菌菌株的初步筛选表明，P.pinsitus是一种漆酶产生菌，P.pinsitus产生漆酶是由2，5-二甲代苯胺诱导的。首先，从诱导的菌株的上清液中分离漆酶。阴离子交换层析证实，一种约为65kD(在SDS-PAGE上测得)的蛋白质具有漆酶活性。对该酶进行充分纯化，以便得到几种内肽序列，和N-末端序列。初步的序列资料表明，这种漆酶与Coriolus hirsutus的漆酶以及一种未鉴定的担子菌漆酶有明显的同源性(Coll等，Appl.Environ.Microbiol.594129-4135，1993)。根据上述序列信息设计出PCR引物，并对从P.pinsitus中分离的cDNA进行PCR。通过PCR获得了一条预计大小的带，而且，分离得到的与纤维素酶信号序列连接的片段被证实可在米曲霉(A.Oryzae)中表达一种活性漆酶，但表达水平很低。上述PCR片段之一还被用作筛选P.pinsitus cDNA文库的探针。以这种方式鉴定得到100个以上的阳性克隆。对这些阳性克隆进行特征分析，并对最长克隆的末端测序；在这些克隆中，没有发现一个具有完整长度。还进行了分离完整长度克隆的进一步努力。用按上述方法分离到的最完整的cDNA片段检测一个5-6kb BamHI大小选择的P.pinsitus基因组文库。初步筛选证实本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种ＤＮＡ结构，带有一段编码一种多孔菌属（Ｐｏｌｙｐｏｒｕｓ）漆酶的序列。

【技术特征摘要】
...

【专利技术属性】
技术研发人员：DS亚夫尔，F许，H达尔伯吉，P施耐德，DA阿斯林格，
申请(专利权)人：诺沃奇梅兹生物技术有限公司，诺沃奇梅兹有限公司，
类型：发明
国别省市：US[美国]