提供了两阶段的热处理方法，以改进包含具有过水解活性的酶的重组微生物生物质的可加工性。更具体地，提供了处理包含具有过水解活性的栖热袍菌属乙酰木聚糖酯酶的重组微生物生物质的方法，使得微量过滤可以被用于部分纯化和/或浓缩蛋白质制备物。所述乙酰木聚糖酯酶可以被用于生产适用于多种应用如清洁、杀菌、消毒、漂白、木浆处理、和纸浆处理应用中的过氧羧酸。
【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及重组微生物生物质加工和酶的纯化领域。更具体地，提供了利用微量过滤改进部分地纯化和/或浓缩具有过氧水解活性的栖热袍菌属(Thermotoga sp.)乙酰木聚糖酯酶的能力的方法。
技术介绍
过氧羧酸组合物可为有效的抗微生物剂。已经描述了使用过氧羧酸清洁、灭菌和/ 或消毒硬质表面、织物、肉制品、活植物组织和医疗器械以杀灭不良微生物生长的方法(美国专利公开6，545, 047 ;美国专利公开6，183,807 ;美国专利公开6，518，307 ;美国专利申请公布2003-0026846 ;和美国专利公开5，683，724)。过氧羧酸也已被用于多种漂白应用中，包括但不限于木浆漂白/去木质化和衣物洗涤护理应用(欧洲专利1040222B1 ;美国专利公开5，552，018 ;美国专利公开3，974，082 ;美国专利公开5，296，161 ;和美国专利公开5，364，554)。在Imin至5min反应时间内和中性至碱性pH下，所期望的过氧羧酸有效浓度可以根据产品的应用而变化(例如，对于中性PH下的医疗器械消毒而言大约500ppm至lOOOppm，对于衣物漂白或消毒应用而言大约30ppm至80ppm)。结构上被归类为糖酯酶家族7 (CE-7)的成员的酶，已被用作过水解酶(perhydrolases),于碱性至酸性pH范围(从大约pH 10至大约pH 5)在水中催化过氧化氢(或替代性的过氧化物试剂)与羧酸的烷基酯的反应，以产生有效浓度的过氧羧酸，所述过氧羧酸用于诸如消毒(例如医疗器械、硬质表面、纺织品)、漂白(例如木浆或纸浆加工/去木质化、纺织品漂白和衣物洗涤护理应用)、以及其他衣物洗涤护理应用如脱色、除臭、和消毒的应用(公布于DiCosimo等人的美国专利申请2008-0176783、2008-0176299、2009-0005590、和2010-0041752中)。CE-7酶类已被发现具有针对酯类尤其是醇、二醇和三醇的乙酰基酯类的过水解的高的特异性活性。DiCosimo等人的公布的美国专利申请2010-0087529描述了来源于几种栖热袍菌属的几种变体CE-7过水解酶，所述变体CE-7过水解酶当被用于从羧酸酯类制备过氧羧酸时具有较高的过水解特异性活性和/或改进的针对过水解的选择性。公布的美国专利申请2010-0087529中描述的变体中的一种，海栖热袍菌(Thermotoga maritima) C277S,表现出相对于海栖热袍菌(T. maritima)野生型酶显著改进的特异性活性。酶的重组微生物生产经常包括用以从生物质的其他组分部分或完全地纯化和/或浓缩所述重组酶的一个或多个下游的生物质处理步骤。然而，当在微量过滤膜上过滤或浓缩蛋白质制备物时遇到了很大的困难。过滤的目的是使包含过水解酶的溶液通过膜，同时在保留物中保留大于O. 2微米或O. 45微米的微粒。蛋白质经常至少部分地被膜保留而不是通过膜，而膜的孔隙率是使得所述蛋白质应当自由地通过它。可以不利地影响回收和/或浓缩所期望的酶催化剂的能力的生物质组分之一，是DNA在细胞匀浆中的存在。然而，外源的脱氧核糖核酸酶(DNAse)的添加可能不是高性价比的，尤其是对于工业规模的发酵，并且哺乳动物来源的DNAse的使用在代加工发酵中可能是不合乎期望的。有待解决的问题是提供容易的和高性价比的方法来获得包含具有过水解活性(perhydrolytic activity)的重组酶的浓缩物,优选不包括外源的脱氧核糖核酸酶的使用的方法。专利技术概沭通过提供适用于处理包含至少一种具有过水解活性的嗜热酶的微生物细胞匀浆的两阶段热处理方法，已解决了上述问题。经热处理的微生物细胞匀浆中的不溶性组分被移除，而所得到的包含过水解酶的溶液随后被浓缩，以产生包含所述过水解酶的浓缩物。 在一个实施方案中,提供了方法,所述方法包括a)提供包含可溶性和不溶性组分的微生物细胞匀浆，其中所述微生物细胞匀浆包含重组生产的具有过水解活性的嗜热酶；b)使所述微生物细胞匀浆在40°C至65°C的温度范围内经受至少4小时但不超过24小时范围的第一热处理；c)使来自步骤b)的经热处理的微生物细胞匀浆在75°C至85°C的温度范围内经受5分钟至4小时范围的第二热处理；d)通过离心或过滤从进行步骤b)和步骤c)之后获得的微生物细胞匀浆移除不溶性组分，以获得包含重组生产的具有过水解活性的嗜热酶的溶液；以及e)通过过滤、蒸发或蛋白质沉淀和再溶解的组合，浓缩步骤d)的包含嗜热酶的溶液，从而获得包含具有过水解活性的重组嗜热酶的浓缩物。在另一个实施方案中，步骤a)的微生物细胞勻衆是大肠杆菌(Escherichiacoli)细胞匀浆。在另一个实施方案中，外源的核酸酶不存在于步骤a)至d)中。在另一个实施方案中，固体组分从进行步骤b)和步骤c)之后获得的微生物细胞匀浆的移除在步骤d)中使用过滤进行。在另一个实施方案中，固体组分从进行步骤b)和步骤c)之后获得的微生物细胞匀浆的移除在步骤d)中使用具有O. 45微米至O. 20微米范围尺寸排阻限的膜进行。在另一个实施方案中，步骤d)中使用的膜保留具有大于O. 2微米的平均直径的不溶性微粒。在另一个实施方案中，不溶性组分从进行步骤b)和步骤c)之后获得的微生物细胞匀浆的移除在步骤d)中使用离心进行。在另一个实施方案中，步骤d)中产生的溶液的浓缩在步骤e)中使用过滤进行。在另一个实施方案中，步骤d)中产生的溶液的浓缩在步骤e)中使用具有IOOkDa至30kDa范围的尺寸排阻限的膜进行。在另一个实施方案中，步骤d)中产生的溶液的浓缩在步骤e)中使用蒸发进行。在另一个实施方案中，步骤d)中产生的溶液的浓缩在步骤e)中使用蛋白质的沉淀和再溶解的组合进行。在另一个实施方案中，所述重组生产的嗜热酶包括CE-7特征基序，所述基序包括对应于SEQ ID NO 8的氨基酸位置118-120的RGQ基序； 对应于SEQ ID NO 8的氨基酸位置186-190的GXSQG基序；和对应于SEQ ID NO 8的氨基酸位置303-304的HE基序。在另一个实施方案中，所述具有过水解活性的嗜热酶是来源于栖热袍菌属的乙酰木聚糖酯酶。在另一个实施方案中，所述嗜热酶包含选自SEQ ID NO 2、3、4、5、6、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、24、25、26、27、28、30、31、32、33、34、36、37、38、39、40、42、43、44、45、和46的氨基酸序列。附图概沭图IA至1D。不同处理步骤之后的细胞裂解物上层清液的层析谱(附图说明图1A)粗制细胞裂解物，(图1B)在50°C孵育后的细胞裂解物，(图1C)在50°C孵育和在75°C热处理后的细胞裂解物，和(图1D)在75°C热处理后的细胞裂解物(没有50°C的孵育)。所有的层析谱具有相同的垂直标度，从-100至+4500mAU。图2A至2C。不同处理步骤之后的细胞裂解物上层清液的层析谱(图2A)均质化和在50°C孵育，(图2B)在50°C孵育和均质化，和(图2C)在50°C孵育然后均质化，随后在75°C热处理。所有的层析谱均具有相同的垂直标度，从-100至+4500mAU。图本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...
【专利技术属性】
技术研发人员：R迪科西莫，A本巴萨，RR佐兰兹，
申请(专利权)人：纳幕尔杜邦公司，
类型：
国别省市：
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