经修饰家族5纤维素酶及其用途制造技术

本发明专利技术涉及经修饰家族5纤维素酶，其包含非天然丙氨酸、丝氨酸或苏氨酸对363位氨基酸的替换，所述位置通过经修饰家族5纤维素酶与SEQ?ID?NO：1所示里氏木霉Cel5A氨基酸序列的71至397位氨基酸之间的比对来确定，本发明专利技术还涉及包含所述家族5纤维素酶的酶混合物。本发明专利技术还提供了包含编码所述经修饰家族5纤维素酶的核酸序列的遗传构建体，以及包含所述遗传构建体的经遗传修饰的微生物。本发明专利技术还提供了用于生产所述经修饰家族5纤维素酶的方法。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及经修饰的纤维素酶及其用途，尤其涉及用于处理含纤维素之制品的经修饰家族5纤维素酶。
技术介绍
纤维素酶被广泛用于改善含纤维素之织物的外观和柔软度。纤维素酶的一个常见应用是用于处理牛仔布(denim)织物以赋予它们“石磨水洗”外观。这种方法在业内被称为“生物打磨(bio-stoning)”。纤维素酶在很大程度上已取代了石子用于生产消费者所期望的柔软的褪色牛仔布。纤维素酶的第二个广泛应用是除去织物中或织物上的棉花绒毛和疏松的表面纤维。这种方法(称为“脱绒毛(depilling)”或“生物抛光”)使织物表面光滑，进而改善其柔软度和外观。纤维素酶处理还有助于防止随后形成使服装看上去变旧的 纤维绒球(Pill)。真菌例如木霉属(Trichoderma)分泌大量不同的纤维素酶(本文也称作“酶混合物”)，其各自被称为组分。这些酶组分中较为常见的包括纤维二糖水解酶(cellobiohydrolase, CBH)、内切葡聚糖酶(endoglucanase, EG)和 β -葡糖苷酶。纤维素酶组分通常包含纤维素结合结构域(cellulose binding domain, CBD)和催化结构域。这两个结构域之间的区域(称为“接头”)充当CBD和催化结构域之间的柔性间隔物。纤维二糖水解酶(CBH)和内切葡聚糖酶(EG)组分可进一步分成糖基水解酶家族(Davies和Henrissat, 1995),其中一些已被鉴定为有助于改善织物的外观和手感。里氏木霉(Trichoderma reesei)是一种已经进行过广泛研究并且对于纤维素酶生产而言具有工业重要性的真菌。它产生至少六种基因上不同的纤维素酶两种纤维二糖水解酶(Cel7A和Cel6A，以前分别称为CBH I和CBH II)和至少四种内切葡聚糖酶(Cel7B、Cel5A、Cell2A和Cel45A，之前分别称为 EGI、EGI I、EGI11 和 EGV)。已经通过改变分泌的酶混合物中纤维二糖水解酶和内切葡聚糖酶组分的相对比例(与天然混合物相比)来尝试改善用于纺织应用的纤维素酶混合物的特性。例如，WO92/17574公开了一种方法，其涉及改变EG型组分相对于CBH I型组分(Cel7A)的量以使其蛋白重量比大于5 I。与含较大量CBH I型(Cel7A)组分的织物相比，用这种组合物处理的含棉织物在纺织加工期间表现出更低的强度损失。也已通过增加酶混合物中单一组分的含量来实现脱绒毛和生物打磨的改善。美国专利No. 5，858，767公开了木霉纤维素酶制备物，其在其他方面背景正常的纤维素酶组合物中富含CBHII纤维二糖水解酶(Cel6A)。发现这样的组合物在脱绒毛应用中改善织物的外观。美国专利No. 5，874，293公开了富含EGII内切葡聚糖酶(Cel5A)的纤维素酶混合物，其显示出在生物打磨应用方面的改善。EP 866165公开了在脱绒毛应用方面具有改善的富含EGII(Cel5A)的酶组合物。但是，尽管进行了这些努力，但是仍然需要在织物处理或纤维素酶常规使用的其他领域中更有效的改进纤维素酶及其组合物。尤其是，仍然需要催化效率更高的纤维素酶，以改善方法的经济性。可通过改善酶混合物中组分的比活性来满足这样的需要。通过提供更有活性的纤维素酶，可使得所需要的酶减少，进而能够显著减少加工成本。研究者已通过蛋白质工程对家族5纤维素酶(本文也称作“Cel5”)进行了修饰，其目的是改善在生物质产生乙醇的过程中将纤维素有效转化为葡萄糖的活性。在解纤维热酸菌(Acidothermus celIulolyticus)Cel5A(SEQID NO 13, AcCel5A)中，Y245G 突变提高了酶对经稀酸预处理的黄杨锯屑的活性(Baker等，2005)。活性的提高主要是由于纤维二糖抑制的减少。使用羧甲基纤维素(carboxymethyl cellulose, CMC)作为底物，携带多个催化结构域和 CBD 突变的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)(菌株 BME-15) Cel5A (SEQ ID NO:14，BsCel5A)变体表现出比活性提高为高达2. 68倍(Lin等，2008)。但是，最佳突变体达到的活性水平为4. 88U/mg，而所报道的木霉EGII对相同底物的活性为39. 9U/mg(Xiao等，2002)。此外，已研究了遗传修饰对里氏木霉Cel5A(TrCel5A，SEQ ID NO :1)在高于其最适·范围的PH值下活性的影响。来自里氏木霉的市售内切葡聚糖酶在4至6的pH范围中具有最佳活性。这些研究的目的是提高在更高PH值的酶活性，使得其能够用于在中性或碱性条件下运行的工业生产方法中。通过定向进化，在成熟TrCel5A纤维素酶(无分泌信号)中鉴定到突变N321T使所述酶的最适pH比野生型酶增加O. 6至O. 8个pH单位(Wang等,2005)。该位置的定点饱和(site-saturation)表明将N替换为R使得最适pH的改变最大，增加约I. 4个pH单位(Qin等，2008a)。然而，与野生型相比，这种变体的比活性大大降低。依次进行易错PCR和 DNA 改组(DNA shuffling)步骤之后，分离了变体 Q139R/L218H/W276R/N342T (相当于SEQ ID :1中的Q118R/L197H/W255R/N321T)，其最适pH增加I. 4个单位而比活性无显著降低(Qin 等，2008b)。对来自解纤维芽孢杆菌(Bacillus cellulosilyticus)的家族5嗜碱性纤维素酶NKl (SEQ ID NO :15 ;BcNKl)(之前称为芽孢杆菌属(Bacillus sp. )N_4)的研究表明，催化结构域的C端部分对于酶的嗜碱性是关键的，特别是残基S287和A296 (Nakamura等，1991 ;Park等，1993)。将这些残基突变为枯草芽孢杆菌中性纤维素酶(Bacillus subtilisneutral cellulase, BSC)中的相同残基使得解纤维芽孢杆菌NKl的pH谱与枯草芽孢杆菌的pH谱非常相似。在这两种突变中，相比于A296S，S287N对pH谱产生更大的影响。
技术实现思路
本专利技术的一个目的是提供经修饰家族5纤维素酶。本专利技术涉及经修饰家族5纤维素酶及包含它的酶混合物。本专利技术还涉及包含编码经修饰家族5纤维素酶之核酸序列的基因构建体，用于从宿主菌株中产生经修饰家族5纤维素酶的方法，以及经修饰家族5纤维素酶在纺织处理(包括但不限于脱绒毛和生物打磨)中的用途。本专利技术提供了经修饰家族5纤维素酶，其包含丙氨酸、丝氨酸或苏氨酸对363位氨基酸的替换。通常，363位的替换氨基酸是非天然的。例如，这意指经修饰家族5纤维素酶所来源的亲本或野生型纤维素酶在363位上不是丙氨酸、丝氨酸或苏氨酸。如下文所述，氨基酸替换的位置通过经修饰家族5纤维素酶与SEQ ID NO : I所示里氏木霉Ce 15A氨基酸序列的比对来确定。本专利技术还涉及包含上面定义的经修饰家族5纤维素酶的酶混合物。经修饰家族5纤维素酶和包含它的酶混合物可用于处理含纤维素的制品。在一个实施方案中，本专利技术提供了一种用于生物打磨的方法，其包括使牛仔布织物或本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...

【专利技术属性】
技术研发人员：纳比尔·马斯里，帕特里克·圣皮埃尔，桑德拉·莫蒂默，克里斯·希尔，
申请(专利权)人：埃欧金生物制品公司，
类型：
国别省市：