本发明专利技术公开了一种用于特定植物纤维高效水解的纤维素酶的生产方法，纤维素酶产生菌经过活化培养后，分别以甘蔗渣等天然植物纤维作为底物，将纤维素酶产生菌接种至产酶培养基中进行纤维素酶的诱导，发酵产酶，取出发酵液，过滤、盐析、透析获得粗酶液。天然植物纤维的组成不同，其诱导产生的纤维素酶酶系组成和降解天然植物纤维的能力也有差异。比如，甘蔗渣诱导制备的纤维素酶，降解甘蔗渣的能力较强；而甘蔗渣诱导制备的纤维素酶对于其他天然植物纤维的降解能力较差。本发明专利技术提供的一种用于特定植物纤维高效水解的纤维素酶生产方法，具有操作简便，工艺简单，可为天然植物纤维降解酶的工业生产提供了指导性原则。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种纤维素酶的生产方法，尤其涉及。
技术介绍
木质纤维素是地球上分布最广和含量最丰富的可再生有机资源，它经过水解可以制得单糖，然后单糖经微生物发酵可进一步生产低聚糖、单细胞蛋白、酒精和有机酸等有机原料和燃料。因此纤维素资源作为能源物质开发具有很大前景。纤维素，木质纤维素主要由纤维素、半纤维素和木质素组成，半纤维素和纤维素微纤维间以氢键联接，形成的空间结 构是植物细胞壁的主体框架，而木质素内部除了有强大的氢键连接外，还与半纤维素通过共价键形成稳定的木质素碳水化合物复合体。由于复杂的结构特征，木质纤维素的纤维素酶解率很低。纤维素酶是复合酶，也是诱导酶，必须在诱导剂的作用下才能大量的表达。不同的诱导剂对里氏木霉表达纤维素酶的诱导效果和使用价值是不同的，诱导里氏木霉产纤维素酶的物质主要是一些糖类，包括多聚糖、寡糖和单糖等。其中以纤维素、槐糖的诱导效果最好，乳糖和纤维二糖的诱导效果次之，山梨糖独特的诱导能力有着特殊的价值。然而这些单糖或寡糖诱导物成本较高，难于应用于工业化生产。商品纤维素酶的生产是以纤维素作为诱导物，其合成的纤维素酶系相对简单，对于有着复杂结构的天然木质纤维素的降解率很低。目前纤维素酶的生产中诱导底物主要采用微晶纤维素，现有工艺生产的纤维素酶对于单纯的纤维素降解能力较强，但是对于天然植物纤维的降解能力很差，主要是因为生产过程中采用的诱导方法和诱导底物选择方面的不足。因此，如果可以采用有效的诱导模式和合适的诱导底物，则可以大大提高天然植物纤维的转化率和生物质能源的产率。
技术实现思路
专利技术目的本专利技术的目的在于针对现有技术的不足，提供一种可工业化生产用于特定植物纤维高效水解的纤维素酶的生产方法。技术方案本专利技术所述用于特定植物纤维高效水解的纤维素酶的生产方法，包括如下步骤 (1)底物选取取特定植物纤维作为底物； (2)纤维素酶产生菌的活化培养将纤维素酶产生菌接种至含有活化培养基的器皿中静置培养制得纤维素酶产生菌的活化培养液； (3)纤维素酶的诱导将步骤(I)的底物作为诱导物，制备产酶培养基；将步骤(2)的纤维素酶产生菌的活化培养液接种到所述产酶培养基中发酵产酶，在25 30°C，转速为100 180 r/min条件下培养，发酵时间为3 7 d，得到发酵液；其中，所述产酶培养基的配方为诱导物2 6 g/L，葡萄糖I 3 g/L，微晶纤维素2 3g/L，蛋白胨 I 2 g/L, (NH4)2SO4 2 3 g/L, KH2PO4 3 4 g/L，尿素 O. 4 O. 6 g/L,CaCl2 · 2H20 O. 6 I. O g/L, MgSO4 · 7H20 0· 4 0. 8g/L, FeSO4 · 7H20 0. 01 0· 04 g/L,MnSO4 · H2O 0· 001 O. 004 g/L, ZnSO4 · 7H20 0. 002 0· 004 g/L, CoCl2 · 6Η20 O. 004 O.008 g/L,吐温 80 0· 3 0· 5 g/L，其余为水，pH 5. O ； (4)发酵液的盐析和透析将发酵液分别进行盐析和透析处理，得到用于特定植物纤维素水解的纤维素酶。本专利技术方法中，采用的特定植物纤维不同，其诱导产生的纤维素酶酶系组成和降解植物纤维的能力也有差异。比如，桑叶诱导制备的纤维素酶，降解桑叶的能力较强；而桑叶诱导制备的纤维素酶对于其他天然植物纤维的降解能力较差。同理，桑叶诱导制备的纤维素酶，降解桑叶的能力较强；而桑叶诱导制备的纤维素酶对于其他天然植物纤维的降解能力较差。为了增强诱导物的活性，增加纤维素酶的产量，比较优选的，步骤(I)中，先对底物 进行粉碎至60目，然后60°C烘干至恒重。步骤(I)中，所述特定植物纤维一般可选择为桑叶和纸浆，当然也可以选择其他特定的植物纤维。步骤(2)中，所述纤维素酶产生菌为黑曲霉、里氏木霉、绿色木霉或康宁木霉。纤维素酶产生菌的活化培养可以按照通常的方法进行，可以单独进行固态活化培养或液态活化培养，但是，为了增强纤维素酶产生菌的活性，优选的，对步骤(2)中纤维素酶产生菌的活化培养通过如下两步完成 (2-1)纤维素酶产生菌的固态培养活化 在无菌条件下，将纤维素酶产生菌接种至PDA固体培养基上，28°C恒温静置培养3-4d，然后4 °C储存； (2-2)纤维素酶产生菌的液态培养活化 将纤维素酶产生菌的斜面培养基取出，在无菌条件下挑取一环孢子，并接种至装有液态活化培养基的锥形瓶中，在28 °C下静置培养2 d。步骤(4)中，所述盐析过程为，将发酵液取出常温常压过滤，在4°C和磁力搅拌器匀速搅拌条件下进行盐析，添加硫酸铵的饱和度达50%，搅拌充分混合30min。为了进一步增强固液分离效果，盐析后再在10000 r/min条件下离心10 min。步骤(4)中，所述透析过程为，将盐析后的发酵液注入透析袋中，在pH为4. 8、温度为4°C的O. 05M的柠檬酸一朽1檬酸钠缓冲液中透析24 h。有益效果本专利技术方法用来诱导产纤维素酶的材料廉价而且来源丰富，解决目前纤维素酶的生产过程中酶活性低的难题，有助于解决生物质能源生产中的瓶颈问题。本专利技术方法操作简便，工艺简单，而且对于特定植物纤维的水解率高。具体实施例方式下面对本专利技术技术方案进行详细说明，但是本专利技术的保护范围不局限于所述实施例。实施例I :底物的选取和处理 用粉碎机将桑叶和纸浆粉碎至60目，最后于60°C烘至恒重。实施例2 :诱导产生纤维素酶 按照如下步骤进行 一、黑曲霉的活化培养 I、黑曲霉的固态培养活化 在无菌条件下，将黑曲霉干粉接种至PDA培养基上，28°C恒温静置培养6 d，然后储存于4 °C环境中制备成斜面培养基。 PDA培养基的配方为马铃薯200 g、蔗糖20 g、水1000 mL、琼脂20 g。2、对黑曲霉的液态培养活化 将储存于4 °C冰箱中的黑曲霉的斜面培养基取出，在无菌条件下挑取一环孢子，并接种至装有50 mL活化培养基的锥形瓶中。最后在28 °C下静置培养2 d。液态活化培养基的配方为葡萄糖10g/L，蛋白胨I g/L，吐温80 0.5 g/L,(NH4)2SO4 I. 4 g/L, KH2PO4 2 g/L，尿素 O. 3 g/L, CaCl2. H2O O. 4 g/L, MgSO4 · 7H20 0. 3 g/L，FeSO4 ·7Η20 0.005 g/L，MnSO4 · H2O 0.0016 g/L, ZnSO4 · 7H20 0.0014 g/L, CoCl2 · 6H200. 0037 g/L, pH 5. 0 ;最后在 121°C下灭菌 20 min。二、纤维素酶的诱导 分别取O. 3g经实施例I粉碎的桑叶和纸浆为诱导物制备产酶培养基，进行液态发酵产纤维素酶。在无菌条件下，量取5 mL上述制备的黑曲霉活化培养液至产酶培养基中，发酵总体积为50 mL，最后于28°C，180 r/min下培养5 d，然后将发酵液取出并过滤，滤液即为粗酶液。产酶培养基的配方为诱导物(分别为桑叶和纸浆)6 g/L，葡萄糖I. 5 g/L，微晶纤维素 3 g/L，蛋白胨 2 g/L, (NH4)2SO4 2. 8 g/L，KH本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种用于特定植物纤维高效水解的纤维素酶的生产方法，其特征在于包括如下步骤：（1）底物选取：取特定植物纤维作为底物；（2）纤维素酶产生菌的活化培养：将纤维素酶产生菌接种至含有活化培养基的器皿中静置培养制得纤维素酶产生菌的活化培养液；（3）纤维素酶的诱导：将步骤（1）的底物作为诱导物，制备产酶培养基；将步骤（2）的纤维素酶产生菌的活化培养液接种到所述产酶培养基中发酵产酶，在25～30℃，转速为100～180？r/min条件下培养，发酵时间为3～7？d，得到发酵液；其中，所述产酶培养基的配方为：诱导物2～6？g/L，葡萄糖1～3？g/L，微晶纤维素2～3？g/L，蛋白胨1～2？g/L，(NH4)2SO4？2～3？g/L，KH2PO4？3～4？g/L，尿素0.4～0.6？g/L，CaCl2·2H2O？0.6～1.0？g/L,？MgSO4·7H2O？0.4～0.8g/L，FeSO4·7H2O？0.01～0.04？g/L，MnSO4·H2O？0.001～？0.004？g/L，ZnSO4·7H2O？0.002～0.004？g/L，CoCl2·6H2O？0.004～0.008？g/L，吐温80？0.3～0.5？g/L，其余为水，pH？5.0；（4）发酵液的盐析和透析：将发酵液分别进行盐析和透析处理，得到用于特定植物纤维素水解的纤维素酶。...
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：李强，谷绪顶，季更生，费娟娟，冯圆圆，
申请(专利权)人：江苏科技大学，
类型：发明
国别省市：
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