一种高效纤维素酶混合物的生产方法及应用技术

本发明专利技术涉及一种高效纤维素酶混合物的生产方法及应用。通过非可溶性碳源进行发酵，不仅节约了纤维素酶发酵成本，而且有效地诱导纤维素酶生产；采用还原糖控制措施，降低碳水化合物的阻遏效应，提高了纤维素酶生产能力；此外，本发明专利技术通过非可溶性碳源结合补料成分和补料速率工艺，构建了新型补料控制方式，在提升纤维素酶产量(生产能力)的同时，还优化了所生产的纤维素酶混合物各组分的配比，纤维素酶活力提高50％以上。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及发酵工程
，具体涉及一种高效纤维素酶混合物的生产方法及 应用。
技术介绍
纤维素酶来源广泛、成分复杂，广泛存在于昆虫体、软体动物体以及真菌、细菌与 放线菌等微生物的代谢产物中，主要生产途径是微生物发酵，其中以丝状真菌和细菌纤维 素酶应用最为广泛，目前主要还是利用真菌来发酵产纤维素酶。 在细菌中大多数好氧细菌和厌氧细菌都富含丰富的纤维素酶系，特别是瘤胃中富 含多种纤维素降解酶系的厌氧菌。世界纤维素市场中的纤维素酶有20 %来自木霉属和曲 霉属。主要是由于丝状真菌具有产酶的诸多优点：①产生的纤维素酶为胞外酶，便于酶的分 离和提取；②产酶效率高，且产生纤维素酶的酶系结构较为合理；③同时可产生许多半纤 维素酶、果胶酶、淀粉酶等。纤维素酶是一个复合酶系，酶系由三类功能不同但又互补的酶 组成。这三类酶分别是内切葡聚糖酶（EG，Cx酶，又称CMC酶）、外切葡聚糖酶（纤维二糖 水解酶，CBH，C1酶）和β-葡萄糖苷酶（BGL，纤维二糖酶）；大多数编码纤维素酶的基因是 染色体基因。纤维素酶系降解原理目前尚无定论，主要有三种作用机理：协同理论、碎片假 说和原初反应假说，其中以协同理论被大部分研究学者和专家所认可，其主要观点为内切 葡聚糖这类酶首先作用于纤维素分子内部的非结晶区，随机识别并水解β-1，4-糖苷键， 将长链纤维素分子截断，产生大量非还原性末端。然后外切葡聚糖酶逐个切下纤维素的非 还原末端水解产生纤维二糖；而葡萄糖苷酶则水解纤维二糖生成葡萄糖。三者缺一不 可，协同作用，也只有在合适的比例和组成下，才能共同作用快速实现纤维素的完全水解。 我国对纤维素酶的研究和生产也已开展了广泛的研究，但大多采用固体发酵方 式，固体发酵虽有许多优越之处，但仍有发酵水平不稳定，不适于大规模生产等弊端，因此 对纤维素酶液体深层发酵的研究很有意义。纤维素酶发酵过程容易受到碳水化合物阻遏效 应（CCR)对酶发酵合成的影响，即在半纤维素和/或纤维素酶合成过程中，往往由于培养 基中存在着葡萄糖、木糖等单糖而通过碳水化合物阻遏效应（CCR)抑制了酶的合成。专利 CN200910091968提供了一种高产纤维素酶的方法，通过补料和溶氧对控制发酵过程菌体浓 度来实现纤维素酶发酵酶活力的提高发酵，其补料为非常复杂的成分，包括价格昂贵的槐 糖、乳糖等及多种微量元素，同时其培养基成本较为昂贵。如何既能解决液体深层发酵后期 营养的快速需求和固体基质降解速率慢的问题，又能解决补加葡萄糖容易造成碳水化合物 阻遏的问题，属于本领域技术人员面临的难题。 此外，纤维素酶产生真菌产生的纤维素酶实质为多种酶的混合物，其包含多种纤 维素酶和半纤维素酶，如纤维二糖水解酶、内切葡聚糖酶、β-葡萄糖苷酶、木聚糖酶、甘露 聚糖酶，还可以包括木糖苷酶、乙酰木聚糖酯酶等。不同的培养和/诱导底物，培养发酵纤 维素酶真菌产生的纤维素酶活性和/纤维素酶混合物的活性（如对木质纤维素底物的降解 活性）往往不同，如何利用一种纤维素酶产生真菌生产高效的纤维素酶混合物，也属于纤 维素酶生产领域技术人员面临的问题。
技术实现思路
为解决现有技术中存在的上述问题，本专利技术通过对现有技术的培养基（产酶培养 基和补料培养基）和液体补料工艺进行优化调整，采用价格低廉固体的培养基，通过构建 培养基中还原糖含量与补料基质之间的关系，不仅解决了以葡萄糖补料造成的CCR效应， 而且提高了纤维素酶生产能力，并且提高了生产的纤维素酶活性（如对木质纤维素底物的 降解活性）。具体的，本专利技术涉及以下技术方案： 本专利技术公开了一种高效纤维素酶混合物的生产方法，所述方法包括：以里氏木霉 或草酸青霉为纤维素酶生产菌进行发酵，整个发酵期间pH始终维持在3. 5-6. 5之间，发酵 至48-60h，开始补料，补料后还原糖含量< 2. 5mg/mL，每4-5h为一补料速率调整阶段，至结 束发酵； 补料的培养基为：葡萄糖母液或木糖母液与硫酸镁、硫酸锌的混合液； 其中葡萄糖母液中，其成分包括：45~60%葡萄糖，15~30%的二糖及5~10% 的多糖，其余为水；木糖母液中，其成分包括：45~70%木糖，5~20%葡萄糖，5~15%阿 拉伯糖，其余为水； 所述补料培养基中还原糖浓度为20 %~40%，硫酸镁浓度为0. 5~1 %，硫酸锌浓 度为0. 003~0. 008% (上述百分比为质量体积百分比）。 上述二糖优选为麦芽糖。 对于上述方法的获得，专利技术人通过对发酵工艺的调整和优化，尤其是对补料培养 基成分及配比的摸索，发现不同的发酵工艺其获得的纤维素酶生产能力和纤维素酶配比有 极大不同，而且补料培养基中碳源的不同，会影响酶活（FPA滤纸酶活）和所制备的纤维素 酶混合物的整体催化效率。经试验，上述工艺条件较其他条件可以有效的提高纤维素酶生 产能力，并且提高生产的纤维素酶活性。 优选的，补料后，1. 5mg/mL<还原糖含量< 2. 5mg/mL。其中，补料后溶氧降低，通过改变发酵搅拌桨叶或搅拌速度来弥补溶氧的降低； 优选的，补料过程通过控制搅拌或更换搅拌桨叶保持溶氧多10 %，更为优选的，保持溶氧 彡 15%〇 优选的，发酵开始pH调整为5. 5-6.0,0-20hpH逐渐下降，用氨水控制发酵培养基 pH3. 5以上，60h后pH回升至5. 5-6. 0后，开始用磷酸调节pH至6. 0以下。 本专利技术所述的发酵培养基为非可溶碳源一一玉米芯、玉米秸杆、小麦秸杆、木糖 渣、脱木素渣等，作为菌株发酵的主要碳源，具体培养基配方如下： 2~7%固体非可溶性碳源（比如秸杆、玉米芯、木糖渣），1~4%麸皮，0.2~ 1%微晶纤维素，0.5~1.5%豆饼粉，0. 1~0.4%硫酸铵，0. 1%尿素，0.3%磷酸二氢钾， 0.05%硫酸镁，0.3%吐温80，121°(：灭菌301^11。 本专利技术还涉及上述生产方法得到的纤维素酶混合物。 此外，本专利技术进一步公开了上述生产方法得到的纤维素酶混合物用于水解纤维素 底物的用途。 优选的，所述纤维素底物可为一种预处理的木质纤维素底物，如预处理的秸杆等。 本专利技术还提供一种水解纤维素底物的方法，包括：将上述生产方法得到的纤维素 酶混合物加至纤维素底物以形成反应混合物，其中纤维素酶混合物以每克底物5-10U的浓 度添加。 本专利技术优点在于： (1)通过非可溶性碳源进行发酵，非可溶性碳源以廉价的农业副产物玉米芯、麸皮 等作为碳源和营养元，价格低廉，节约了纤维素酶发酵成本；此外，非可溶性碳源的使用，并 未降低纤维素酶的生产性能，而且由于不同的碳源使用可诱导出不同活力的纤维素酶，本 专利技术通过对相应发酵培养基碳源的组成和配比优化，可以有效地诱导生产纤维素酶。 (2)采用还原糖控制措施，不仅有效地降低了纤维素酶生产时的碳水化合物的阻 遏效应，而且通过利用纤维素酶生产过程中产生的纤维素酶系、半纤维素酶系将培养基中 的固体基质（非可溶性碳源-玉米芯、秸杆、木塘渣等）降解成葡萄糖而提供营养，解决液 体深层发酵后期营养的快速需求和固体基质降解速率慢的矛盾，同时克服了补加葡萄糖容 易造成碳水化合物阻遏等问题，提高了纤维素酶生产能力。 (3)本专利技术通过葡萄糖母液和木糖母液补料作为补料原料，不仅有效本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种高效纤维素酶混合物的生产方法，所述方法包括：以里氏木霉或草酸青霉为纤维素酶生产菌进行发酵，整个发酵期间pH始终维持在3.5‑6.5之间，发酵至48‑60h，开始补料，补料后控制还原糖含量≤2.5mg/mL，每4‑5h为一补料速率调整阶段，至结束发酵；补料的培养基为：葡萄糖母液或木糖母液与硫酸镁、硫酸锌的混合液；其中葡萄糖母液成分包括：45～60％葡萄糖，15～30％的二糖及5～10％的多糖，其余为水；木糖母液成分包括：45～70％木糖，5～20％葡萄糖，5～15％阿拉伯糖，其余为水；所述补料培养基中还原糖浓度为20％～40％，硫酸镁浓度为0.5～1％，硫酸锌浓度为0.003～0.008％。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：肖林，夏蕊蕊，覃树林，杨建，李红震，孙保剑，
申请(专利权)人：山东龙力生物科技股份有限公司，
类型：发明
国别省市：山东;37