高产纤维素酶真菌的初筛方法技术

本发明专利技术公开了高产纤维素酶真菌的初筛方法，包括以下步骤：依金属离子液的质量计，将其质量0.1-5%的预处理木质纤维素、0.5-3%琼脂、0.1-1%硫酸铵、0.05-0.5%磷酸二氢钾、0.05-0.5%(w/v)TritonX-100置于容器中，在121-128℃消毒灭菌20-30分钟后取出摇匀，待温度冷却到60-90摄氏度时，加入金属离子液，得培养基液；将培养基液倒入消过毒的平板中，凝固后备用；将被筛选的菌株涂布在平板上，置于培养箱中3-20天，通过对平板上各个菌落的生长情况进行选择，挑选具有优良产酶活性的菌株；本发明专利技术是一种廉价、高效的对高产纤维素酶菌株进行初筛的方法，比传统筛选方法具有更强的工业化针对性，能有效的筛选出适应于工业化培养基的高产菌株。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及菌株的筛选方法，具体涉及一种。
技术介绍
广泛意义的纤维素酶是指包含微生物分泌出来的可水解复杂的木质纤维素的纤维素酶的总体，同时也包含半纤维素酶等辅助酶，Endoglucanases, EG,又称葡聚糖内切酶、 内切型纤维素酶，主要作用于纤维素内部的非结晶区，随机水解￠-1,4糖苷键，将长链纤维素分子截短，产生大量带非还原性末端的小分子纤维素)；CelIobiohydrolases,或者CBH 酶，又称葡聚糖外切酶、外切型纤维素酶、纤维二糖水解酶，(这类酶作用于纤维素线状分子还原末端，水解I，4- 3 -D糖苷键，每次切下一个纤维二糖分子，故又称为纤维二糖水解酶)； ^ -葡萄糖苷酶(BG)，这类酶一般将纤维二糖水解成葡萄糖分子。含有几种与纤维素酶作用类似的半纤维素酶，主要是水解木质纤维素外壁的半纤维素。一般微生物所产生的每一种功能的酶并不是唯一的，比如T. reesei所分泌的外切酶有CBHI(占总共酶含量的60%)， CBHII (20%)，CBHIII，内切酶有 EGI (6-10%), EGII-EGIV (5%) ; P -葡萄糖苷酶有 BGI 和 BGII (合起来占0.5%);半纤维素酶有木聚糖酶I，II，III，IV和￠-木糖苷酶。纤维素酶几种酶根据各自的作用和功能协同作用对纤维素进行水解。一些细菌、真菌、植物和原生动物，而且无脊椎动物，包括昆虫、疥虫、环节动物、贝类和线虫类等均可产生纤维素酶。在反刍动物的瘤胃中含有共生的纤维分解菌和原生动物；在高等植物中也含有纤维素酶；在微生物方面，真菌、放线菌及细菌等在一定条件下也可产生纤维素酶。目前用于生产纤维素酶的微生物大多属于真菌，其中研究较多的有木霉属、曲霉属、根霉属和漆斑霉属，其中以1956年发现的木霉属真囷最为突出。实验室层面上对各种产纤维素酶的微生物都有不同程度的研究，工业化层面上一些真菌使用得比较多。虽然我们对促使一些真菌分泌纤维素酶的天然诱导剂及其作用机理还知之甚少，但到目前为止很多的研究已经表明一些可溶性的碳源，比如山梨糖(Sorbose)，乳糖 (Lactose)和槐糖(Sophorose)可以作为较好的诱导剂。一些不溶性碳源，纯的微晶纤维素、木聚糖、预处理的木质纤维素、牛粪、玉米纤维也能起到促使这些真菌产酶的作用。实验室中这些作为碳源以及纤维素酶诱导因子或者诱导因子的前体都有过使用，但是出于经济成本考虑，工业化产纤维素酶一般更适合于采用比较廉价的像秸杆等木质纤维素这样的碳源培养基。纤维素酶具备的水解木质纤维素成糖的能力使得其具有广泛的应用前景，通过对秸杆等木质纤维素水解，将其发酵成糖，在通过发酵等方法制备燃料乙醇或者其他的化工产品，这也是利用木质纤维素制备能源化工产品当中一个关键要素之一，纤维素酶的制备成本和效率也是能否实现生物质基能源化工产品逐渐取代石油能源和化工产品的决定因素之一。当前有很多的科研工作投入到从天然的微生物中寻找具备很强的纤维素酶生产能力的菌株，以及在一些原有较好的菌株基础上通过变异等方式不断提高其产酶的能力，在这些工作当中有一个重要的环节就是对高产菌株的判断方式，或者怎么才能筛选出具备高产能力的菌株。微生物领域中一般采用含有特殊成分的培养基，通过微生物分泌的酶作用于培养基上产生的一些反馈信息的差异来实现这种筛选。目前筛选培养基一般使用纯的纤维素作为碳源和诱导因子的前体，通过微生物分泌的纤维素酶作用于纯的纤维素上，将不溶的纤维素转变成可溶的葡萄糖，通过辨别透明圈的大小来实现在不同菌株产酶能力的一个初步筛选。由于微生物分泌纤维素酶组成比例等受本身诱导因子或诱导因子前体影响较大，简单的说用纯纤维素作为培养基筛选出好的菌株，对纯纤维素水解能力相对较强。但一般不一定对木质纤维素水解能也相对高。与此同时，由于筛选出来的菌株最终的工业化产酶环境不是用纯纤维素作为碳源，更多的利用一些诸如预处理的木质纤维素廉价的碳源。因此传统实验室含纯纤维素筛选配方，对于筛选酶活性差异相对较小，以及选择性较强地筛选出使用木质纤维素作为培养基碳源的发酵环境的优良菌株缺乏针对性，有一定的局限性。
技术实现思路
本专利技术的目的在于；提供一种，针对传统纤维素酶菌株筛选培养基在对工业化筛选中针对性不足等弊端，采用粉碎后预处理的木质纤维素作为主要的碳源和诱导因子前体进行筛选，同时在结合真菌纤维素酶分泌和水解的特点的基础上，通过对高产纤维素酶的生长形态进行评判，筛选出高产的纤维素酶菌株。本专利技术的技术解决方案是该初筛方法包括以下步骤(1)制备培养基首先，依金属离子液的质量计，将含有其质量的0.1-5%的粉碎后的干的50目以上的预处理木质纤维素、0. 5-3%琼脂、0. 1-1%硫酸铵(NH4)2S04、0. 05-0. 5%磷酸二氢钾KH2P04、0. 05-0. 5%(w/v) TritonX-IOO置于容器中，在 121_128°C消毒灭菌20-30分钟后取出摇匀，待温度冷却到60-90摄氏度时，加入金属离子液，得培养基液；然后，将培养基液倒入消过毒的平板中，凝固后备用；(2)接种筛选将被筛选的菌株涂布在平板上，置于培养箱中3-20天，通过对平板上各个菌落的生长情况进行选择，挑选具有优良产酶活性的菌株；根据菌落生长选择性挑选是指在整体菌落平均直径在10毫米以上后，挑选那些菌落直径相对较大，在菌落边缘不产孢子，边缘与固体培养基接触紧密，相对湿润，有肉眼可见或不可见菌丝形成，优先挑选这一菌丝地带相对较宽的菌落，以外菌丝直径与整个菌落直径的比值作为挑选菌株的初筛标准，优先挑选比值相对较大的菌落。其中，所述的金属离子液的制备方法如下首先，制备金属离子浓液，它含有硫酸镁、硫酸亚铁、硫酸锌、硫酸锰、氯化钴和氯化钙，其浓度为金属离子液的10-200倍；其次， 稀释金属离子浓液成金属离子液，并用质量浓度36%的HCl将金属离子液的pH调至1-3， 金属离子液添加的量要确保金属离子在培养基中浓度为硫酸镁MgSO4 7H20 0. 05-lg/L、 硫酸亚铁 FeSO4 7H20 0. l_20mg/L、硫酸锌 ZnSO4 7H20 0. l_5mg/L、硫酸猛 MnSO4 7H20 0. l-10mg/L、氯化钴 CoCl2 6H20 0. l_20mg/L、CaCl 0. 005-0. lg/L。其中，所述的预处理的木质纤维素的处理方法是如下一种或者几种方法的组合 一是利用蒸汽或者超临界过热水在含有质量百分比0-2%的稀酸环境下进行蒸煮1-30分钟，酸是指盐酸、硫酸、亚硫酸、硝酸、磷酸、碳酸中的一种或其组合；二是使用质量浓度0.2- 20%的碱液在温度为60-160摄氏度蒸煮1-600分钟；碱性物质是指氢氧化钾、氢氧化钠、碳酸钠、氨水、生石灰、氢氧化钙中的一种或其组合。其中，所述的木质纤维素为农作物秸杆、草类、林木生物质中的一项或几项的组合；所述的农作物秸杆为稻草、麦草、棉花杆、油菜杆、玉米杆、玉米芯、大豆杆茎、花生杆茎、 葵花杆、甘蔗渣中的一种或几种的组合；所述的草类为芒草、柳枝稷、芦苇中的一种或几种的组合；所述的林木生物质为软木、硬木、锯木屑中的一种或几种的组合。本专利技术的初筛方法是基于真菌产酶的特点真菌是在形成菌丝后在整体本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：熊鹏，周玉珍，宇文伟刚，熊涛，
申请(专利权)人：熊鹏，
类型：发明
国别省市：