本发明专利技术涉及一种新型β-葡萄糖苷酶及其编码基因和应用。本发明专利技术还涉及含有所述编码基因的表达载体和宿主细胞。本发明专利技术还涉及利用所述β-葡萄糖苷酶将纤维素降解过程中所生成的纤维二糖水解为葡萄糖的方法。本发明专利技术的β-葡萄糖苷酶具有耐高温及在中性和弱碱性条件下稳定性好的特点，可良好地应用于工业生产。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物
，涉及一种新型耐高温β -葡萄糖苷酶及其编码基因和应用。
技术介绍
纤维素简介。纤维素是多个葡萄糖残基以β_1，4-糖苷链连接而成的多聚物，是地球上最丰富的可再生的生物质资源。以木质纤维素为原料、用纤维素酶水解纤维素生成葡萄糖，进而发酵为燃料乙醇成为应对当今世界能源危机、环境污染等问题的重要出路。纤维素酶简介。纤维素酶是指能够将纤维素转化成葡萄糖的一系列酶的总称，主要包括内切葡聚糖酶(endo-β -1,4-glucanase, EC 3. 2. I. 4)、外切葡聚糖酶(exoglucanase, EC 3. 2. I. 91)和 β -葡萄糖苷酶(β -glucosidase, EC 3. 2. I. 21)。内切 葡聚糖酶作用于纤维素长链分子的内部将长纤维切成短纤维，外切葡聚糖酶作用于纤维素分子的一端，以两个葡萄糖残基为单位进行切割生成纤维二糖，β -葡萄糖苷酶切割纤维二糖及一些纤维寡糖最终生成单个的葡萄糖分子。葡萄糖苷酶在生物能源领域的作用。作为纤维素复合酶系的重要组成之一，β-葡萄糖苷酶的关键作用主要体现在两个方面一方面，由于纤维二糖积累对其上游内切葡聚糖酶和外切葡聚糖酶的活性具有显著的反馈抑制作用，因此，β-葡萄糖苷酶对纤维二糖的高效水解能力对纤维素的彻底降解起到至关重要的作用。另一方面，除水解活性， 葡萄糖苷酶还具有转糖苷活性，在一定的条件下可以通过转糖苷作用将两个葡萄糖分子合成一个槐糖分子，而已经发现槐糖是纤维素酶基因表达的强诱导物。一般认为丝状真菌中纤维素酶合成的诱导机制是存在于分生孢子和菌丝表面的少量组成型纤维素酶首先降解纤维素生成纤维二糖等寡糖，然后在质膜结合的葡萄糖苷酶的转糖苷作用下，生成槐糖等诱导物，经细胞膜上的组成型透性酶系统进人细胞内，启动纤维素酶的合成。由此可见，提高β_葡萄糖苷酶在纤维素降解体系的催化活性，对于提高纤维素降解体系转化效率及降低纤维素乙醇产业生产成本，具有巨大的商业价值和现实意义。β -葡萄糖苷酶在传统产业中的应用。β -葡萄糖苷酶底物专一性差异很大，除了作用于纤维二糖及纤维糊精而在纤维素产乙醇产业方面发挥重要作用外，还可作用于芳基葡萄糖苷(如熊果甙、水杨苷及生色化合物P-硝基苯基_β -D-吡喃葡萄糖苷)、烷基葡萄糖苷(甲基-D-葡萄糖苷)及β-1，3-葡萄糖苷(昆布二糖)等。因此在其他领域的应用也非常广泛。例如在食品行业中，由于它能将水果中糖苷前体的芳香族化合物释放变为具有浓郁香味的化合物，从而改善茶叶、果汁和果酒的风味，因此其作为特殊的风味酶已得到广泛应用；在医药保健品行业中，β_葡萄糖苷酶可通过生物转化功能，将某些广泛存在的天然产物转化为在自然界稀有甚至不存在的物质。例如，葡萄糖苷酶可将无活性的结合型大豆异黄酮转化为具有生理活性的游离型苷元，进而发挥改善更年期综合症、预防骨质疏松、抗氧化等生物学功能等。β -葡萄糖苷酶的研究历史。β -葡萄糖苷酶广泛存在于自然界中许多植物和微生物体内。由于植物来源的β-葡萄糖苷酶活性远比微生物来源要低，所以其分离主要集中在微生物上。起初人们主要从纯培养微生物中分离，如木霉、青霉、黑曲霉等。随着元基因组学技术的兴起，人们意识到占自然界中微生物种类99 %以上的微生物实际上未可培养，而其中必然蕴藏着丰富的基因资源，所以越来越多的研究者开始将目光集中到纤维素被活跃降解的各种环境系统上，通过构建和筛选各种环境样品的未培养微生物宏基因组文库获得具有不同优良生化性质的β -葡萄糖苷酶新基因，如Walter等人构建鼠大肠未培养微生物的BAC基因文库，并克隆到一个β_葡萄糖苷酶基因(Walter等，Appl EnvironMicrobiol, 71 =2347-2354,2005) ;Ferrer等人构建了奶牛的瘤胃内容物的宏基因组文库，从中克隆到包括9个内切葡聚糖酶基因和I个β-葡萄糖苷酶基因(Ferrer M等，EnvironMicrobiol, 7 =1996-2010,2005.) ;Feng等人报道从兔子盲肠未培养微生物中克隆和鉴定了 4个内切葡聚糖酶和7个β-葡萄糖苷酶基因C(Feng Y等,Appl Microbiol Biotechnol,75 =319-328,2007);唐咸来等人从沼气池宏基因组文库中克隆和鉴定了一个β -葡萄糖苷酶基因等。另外，针对不同工业用途需要不同性质的葡萄糖苷酶，而现有技术中的大部 分，尤其是细菌来源的β_葡萄糖苷酶的活力较低，在产量、理化特性、催化效率等方面也远远不能满足现代工业生产的需求。因而有必要进一步扩大筛选对象或者对已有的酶进行定向进化，从中筛选出酶活较高、理化特性更趋多样化的新的β_葡萄糖苷酶。目前，已经有很多的研究致力于发现或者改造一些现有的β -葡萄糖苷酶，使其具有对高温的较强的耐受性和在高温条件下的稳定性。因为高温不仅可以降低底物的粘滞度提高整体的反应速率；同时，通过对温度的调控，降低温度，还可以控制反应的速度；另外，高温下，一些中常温的微生物较难生存，还可以很大程度上解决工业生产中常见的微生物污染的问题，降低成本。在本专利技术中，我们构建了一个白蚁肠道的元基因组文库，从中筛选到了一个具有高温稳定性的新型β -葡萄糖苷酶基因，并得到了异源可溶表达。
技术实现思路
本专利技术的内容是提供一种新型耐高温葡萄糖苷酶(Bgll)和它的编码基因(bgll)与应用。本专利技术所提供的β-葡萄糖苷酶来源于白蚁肠道元基因组，具有SEQ ID No. 2所示的氨基酸序列。SEQ ID No. 2的序列由I到455个氨基酸残基组成，自SEQ ID No. 2的氨基端的第6-445位为糖基水解酶第I家族保守功能域。该β -葡萄糖苷酶同已知蛋白的氨基酸序列一致性最高为54%。为了使该蛋白便于纯化，可在SEQ ID No. 2所示的氨基酸序列组成的蛋白质的N端或者C端连接上如表I所示的标签。表I标签的序列权利要求1.一种分离的多肽，其特征在于，该多肽选自下组 (a)如SEQID NO : 2所示的多肽； (b)将SEQID NO 2所示的氨基酸序列经过一个或多个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的，且具有(a)多肽功能的由(a)衍生的多肽； (c)具有(a)多肽功能的SEQID NO 2的蛋白片段； (d)在SEQID NO :2的N或C末端具有标签序列，或在其N末端具有信号肽序列的多肽。2.一种分离的多核苷酸，其特征在于，它包含一核苷酸序列，该核苷酸序列选自下组 (1)编码如权利要求I所述多肽的多核苷酸； (2)与多核苷酸(I)互补的多核苷酸。3.如权利要求2所述的多核苷酸，其特征在于，该多核苷酸编码如SEQID N0:2所示氨基酸序列的多肽。4.如权利要求2所述的多核苷酸，其特征在于，该多核苷酸的核苷酸序列如SEQIDNO 1所示。5.—种载体，其特征在于，它含有权利要求2-4任一所述的多核苷酸。6.一种遗传工程化的宿主细胞，其特征在于，它含有权利要求5所述的载体，或其基因组中整合有权利要求2-4任一所述的多核苷酸。7.—种权利要求I所述的多肽的制备方法,其特征在于,该方法包含 (a)培养权利要求6所述的宿主细胞； (b)从培养物中分离出权利要求本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种分离的多肽，其特征在于，该多肽选自下组：(a)如SEQ？ID？NO：2所示的多肽；(b)将SEQ？ID？NO：2所示的氨基酸序列经过一个或多个氨基酸残基的取代、缺失或添加而形成的，且具有(a)多肽功能的由(a)衍生的多肽；(c)具有(a)多肽功能的SEQ？ID？NO：2的蛋白片段；(d)在SEQ？ID？NO：2的N或C末端具有标签序列，或在其N末端具有信号肽序列的多肽。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：周志华，王钱福，钱昌丽，刘宁，严兴，魏维，王倩，谢磊，黄勇平，
申请(专利权)人：中国科学院上海生命科学研究院，
类型：发明
国别省市：
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