一种重组墨吉明对虾溶菌酶及其制备和应用制造技术

一种高杀菌活力溶菌酶的制备方法及其应用。该方法是将墨吉明对虾溶菌酶基因(SEQIDNo.1)连接到真核表达载体pPIC9K中构建重组质粒，并将所形成的重组质粒转化毕赤酵母GS115，对转化子进行甲醇诱导表达，收集上清，经分子筛层析柱纯化后得到对虾溶菌酶。本发明专利技术的酵母表达工艺可以稳定高效地生产溶菌酶，制备工艺不复杂，设备要求简单，生产周期短，成本比较低，无环境污染。所制得的对虾溶菌酶比直接从对虾组织中提取的溶菌酶活性提高了35%，对多种革兰氏阴性和革兰氏阳性细菌均具有高效杀菌作用，因此可以广泛应用在医药、食品、农业和化妆品等行业。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及分子生物学制药
，具体的说是利用生物技术制备墨吉明对虾溶菌酶的方法。本专利技术还涉及该方法制备出来的墨吉明对虾溶菌酶的应用。
技术介绍
溶菌酶是一种能水解粘多糖的碱性酶，它能催化细菌细胞壁中粘多糖N-乙酚胞壁酸和N-乙酞葡萄糖胺之间的β _1，4糖苷键的水解，导致细胞裂解，内容物逸出而使细菌死亡，是一种很有效的广谱性抗菌剂。近来的研究发现溶菌酶的杀菌活性并不仅因为其能够溶解细菌的细胞壁，还因为其蛋白内部存在一个或多个双亲性的蛋白螺旋结构域，它们可以刺穿细菌的细胞膜，造成细菌的正常生理代谢发生紊乱直至死亡。溶菌酶蛋白分子经高温变性后，虽然其水解细菌细胞壁能力丧失，但由于位于分子内部的双亲性的蛋白螺旋结构域暴露在外部，其抗菌能力反而更强了。另外，溶菌酶还有保护炎症部位的正常组织作用、提高单核细胞吞噬外来病菌、抑制细菌内毒素释放和抑制真菌和病毒等作用。它广泛存在于自然界动植物和微生物的组织、体液及分泌物中，在生物机体的抗病性及免疫防御系统中发挥重要作用。溶菌酶作为天然的抗菌剂、免疫增强剂和防腐剂目前广泛应用于医药、食品及饲料等行业。需要特别指出的是，因为人和哺乳动物细胞是没有细胞壁结构的，也不含有肽聚糖成分，故任何来源的溶菌酶对人和哺乳动物均无毒性作用。溶菌酶的应用领域包括以下几个方面1)溶菌酶可以作为防腐剂。它本身是一种天然蛋白质，能被人体作为C和N源吸收代谢，且对人和哺乳动物无任何毒性，因此是一种安全性非常高的食品防腐剂；2)抗生素替代品。目前滥用抗生素带来的问题也越来越受到人们的关注，一是耐药性问题，二是药物残留问题，其副作用是不可忽视的，目前急需开发一种针对不同耐药菌株均有效的“超级抗生素”用于医学治疗和养殖产业。溶菌酶是一种天然无毒的酶制品，它对人类及大部分水生动物和畜禽动物即是体内自身的免疫因子，增强动物机体的免疫力，又可作为医疗和养殖生产中的杀菌剂，降解和杀死常见的致病菌。所以，该溶菌酶可以代替抗生素应用于临床治疗和养殖生产中。幻在食品、饮料和化妆品中作为添加剂使用。溶菌酶集药理、保健和防腐三个功能于一体，作为一种天然蛋白质无任何毒副作用。例如，食品中若加入溶菌酶， 可补充人体内的非特异性免疫因子，增强人体抗感染能力，杀死肠道内的腐败病菌，维持肠道内菌群正常化。若加入到化妆品中，可以治疗由金黄色葡萄球菌、丙酸杆菌和螨虫等引发的痤疮和青春痘的治疗。溶菌酶大体可分为3种类型C型、G型和噬菌体溶菌酶，它们在底物种类和杀菌活性方面存在着比较大的差异。迄今所发现的绝大部分的溶菌酶均属C型(如人溶菌酶和鸡蛋清溶菌酶)。目前生产上常用的溶菌酶都是从鸡蛋清中制备的。但高等动物的C型溶菌酶普遍杀菌活性不高，抗菌谱也不够广，不能杀灭革兰氏阴性细菌。来自低等动物一海洋甲壳类动物中提取的溶菌酶生物化学性质不同于人和鸡蛋白溶菌酶。来自于海洋类甲壳类动物的溶菌酶很少受到温度的影响，有很宽的适应范围。与蛋清溶菌酶相比，它具有嗜低温、抗氧化和杀菌谱广的特点，能特异性地分解革兰氏阳性和阴性菌的细胞壁形成溶菌现象，具有杀菌、防腐、抗病毒等功效，在医药、食品、饲料及化妆品等产业具有独特优势和广阔的市场前景。目前溶菌酶主要从蛋清中提取，由于来源有限，生产工艺复杂，溶菌酶产量十分有限，价格居高不下，难以满足越来越大的市场需求。因此用基因工程手段表达溶菌酶成为很重要的手段。前期的研究者利用RT-CR和RACE-PCR技术，从墨吉明对虾 (Fenneropenaeus merguiensis)机体中克隆得到一种溶菌酶基因(GenBank :EU591712)； 并通过生物信息软件分析得到关于其编码产物的结构特点信息(“Molecular cloning, characterization, expression and antibacterial analysis of a lysozyme homologue from Fenneropenaeus merguiensis", Mol Biol Rep(2009)36 :1587-1595, DOI 10.1007/ sll033-008-9355-8。
技术实现思路
本专利技术目的在于提供一种利用生物技术制备墨吉明对虾溶菌酶的方法及其应用。本专利技术提供一种重组墨吉明对虾溶菌酶，是通过以下方法制备，将墨吉明对虾溶菌酶基因(GenBank :EU591712)(序列如SEQ ID No. 1)连接到真核表达载体pPIC9K中构建重组质粒，并将所形成的重组质粒转化到巴斯德毕赤酵母GS115中，经甲醇诱导表达，然后经分子筛层析柱纯化后得到重组溶菌酶。所述的重组溶菌酶可作为革兰氏阴性和革兰氏阳性细菌的抑菌剂。所述方法的具体操作步骤是1)重组fLysC质粒的构建从新鲜墨吉明对虾中取出墨吉明对虾肠组织，提取总RNA，并通过反转录PCR扩增墨吉明对虾溶菌酶的cDNA，用引物FM-7和FM-8进行PCR扩增。PCR产物纯化后与真核表达载体pPIC9K分别用EcoRl和NotI酶切，回收酶切片段，将这二片段于室温用T4连接酶连接2-8小时，连接液转化入大肠杆菌，筛选转化子提取质粒，即为重组fLysC质粒。2)溶菌酶的表达与制备将重组质粒DNA用Bglll酶解，用电击法将质粒DNA转化至酵母菌GSl 15中，并涂布于含有氨苄青霉素LB固体培养基上培养上，筛选转化子即为GS115/fLysC，将选出的高拷贝转化菌株接种至混有溶壁微球菌的BMMY固体培养基中继续培养，观察不同菌株对溶壁微球菌的抑菌活性，筛选高活性的重组菌株。3)重组墨吉明对虾溶菌酶的浓缩纯化将重组酵母菌株先在BMGY液体培养基中， 30°C摇瓶培养，250转/分钟；当OD值达到8. O士0. 5时，更换培养基，用原培养物10%体积的BMMY培养基，继续培养；每24h添加甲醇，保持甲醇浓度0. 3% (ν/ν)，4天后结束培养， 离心收集培养液上清；将该培养液上清经过硫酸铵饱和沉淀然后透析去除多余硫酸铵，再经过s印hadeX-G75分子筛层析柱洗脱，用0. 05M pH8. OTris-HCI连续洗脱，然后将洗脱液在冻干机上冻干，得到重组溶菌酶干粉。所述步骤1)中PCR使用特异性引物FM-7和FM_8，引物两端分别引入EcoRI和 Notl限制性酶切位点FM-7 :5’ —GCAGAATTCCCCTCCATCGTGGGCCGTGATTGC—3'FM-8 5，—AAGTTTTGTAAGGTCACGTCCAGCCAGCTCAT—3，本专利技术还提供了上述重组墨吉明对虾溶菌酶在制备抑菌剂中的应用。所述的溶菌酶可作为作为革兰氏阴性和革兰氏阳性细菌的抑菌剂。对由上述方法制得的重组墨吉明对虾溶菌酶进行了相关的生物学活性分析，发现该酶具有很强的广谱抗菌作用，对常见的革兰氏阳性菌和阴性菌金黄色葡萄球菌、溶血性链球菌、痢疾志贺氏菌、 副溶血弧菌、创伤弧菌、嗜水气单胞菌、铜绿假单胞菌、粘质沙雷氏菌均具有明显的抑菌作用，尤其是对临床医疗和养殖生产中常见的致病细菌和弧菌杀菌力极强。并且发现该重组墨吉明对虾溶菌酶比直接从对虾组织中提取的溶菌酶活性提高了 35% ；与鸡蛋清溶菌酶相比，抑菌谱范围要广很多，尤其对于鸡蛋清溶菌酶不能作用的革兰氏阴性菌抑菌效果更明本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：麦维军，祈增华，李国辉，陈慧卿，周亚竟，陈克平，陈焰，
申请(专利权)人：江苏大学，
类型：发明
国别省市：