本发明专利技术的课题是从解纤维素枝顶孢分离了包含分类于内切葡聚糖酶、β-葡萄糖苷酶的纤维素酶基因的基因组DNA，通过解析其碱基序列，确定了内切葡聚糖酶以及β-葡萄糖苷酶基因。对已知的内切葡聚糖酶以及β-葡萄糖苷酶的氨基酸序列进行了深入比较，发现了在解纤维素枝顶孢中也能够保守的氨基酸序列，基于本信息设计了各种引物。使用这样设计的各种引物，以基因组DNA或cDNA作为模板实施了PCR。其结果，得到了内切葡聚糖酶以及β-葡萄糖苷酶的基因片段，因而以本基因片段为基础，设计引物，通过继续进行PCR，扩增出9种内切葡聚糖酶以及β-葡萄糖苷酶的基因，解析了其碱基序列，从而完成了本发明专利技术。
【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及纤维素酶，具体涉及解纤维素枝顶孢(Acremonium cellulolyticus) 来源的纤维素酶、编码该纤维素酶的多核苷酸、利用了该多核苷酸的纤维素酶的制造方法及其用途。而且，在本说明书中，“多核苷酸”包括例如DNA或者RNA、或它们的修饰体或者嵌合体，优选为DNA。
技术介绍
纤维素酶是分解纤维素的酶的总称，一般而言，微生物生产的纤维素酶中包括多种纤维素酶成分。纤维素酶成分根据其底物特异性可分为纤维二糖水解酶、内切葡聚糖酶、 β -葡萄糖苷酶这3类,对于作为产生纤维素酶的丝状真菌的黑曲霉(Aspergillus niger) 而言，可以认为其最多产生4种纤维二糖水解酶、15种内切葡聚糖酶、15种β -葡萄糖苷酶。因此，在对微生物产生的纤维素酶进行产业利用时，是以该微生物生产的各种纤维素酶成分的混合物的形式加以利用。丝状真菌解纤维素枝顶孢的特点是生产糖化力强的纤维素酶(非专利文献I)，有报告称，其在饲料用途、 青贮饲料用途方面具有高有用性(专利文献1-3)。此外，对其所含有的纤维素酶成分(专利文献4-10)进行了详细研究，已知其与其他丝状真菌一样分泌多种纤维素酶成分。可以认为，在限定于某种用途的情况下，多种纤维素酶成分中，特定的数种酶成分对其用途而言是重要的。因此，如果能够根据利用的用途对微生物生产的纤维素酶进行纤维素酶成分组成的最适化，则可以期待获得活性更高的纤维素酶。为止的最佳方法是通过基因重组方法导入特定的酶基因进行过度表达、或者缺损特定的酶基因。然而，对于解纤维素枝顶孢的情况，在多种纤维素酶成分中，仅分离出了 2种纤维二糖水解酶基因(专利文献4、5)以及I种β-葡萄糖苷酶基因(专利文献10)，现状是，对于其他的纤维素酶无法利用基因导入进行表达增强、或者利用缺损进行表达抑制。在这样的背景中，为了通过基因重组技术将解纤维素枝顶孢产生的纤维素酶的组成最适化，希望分离出内切葡聚糖酶、β_葡萄糖苷酶等多糖分解酶基因。现有技术文献非专利文献非专利文献 I !Agricultural and Biological Chemistry,(日本)，1987 年，第51 卷，p.65专利文献专利文献I :日本特开平7-264994号公报专利文献2 :日本专利第2531595号说明书专利文献3 :日本特开平7-236431号公报专利文献4 :日本特开2001-17180号公报专利文献5 :国际公开W097/33982号小册子8专利文献6 :国际公开W099/011767号小册子专利文献7 日本特开2000-69978号公报专利文献8 :日本特开平10-066569号公报专利文献9 :日本特开2002-101876号公报专利文献10 日本特开2000-298262号公报
技术实现思路
专利技术所要解决的问题本专利技术的课题是通过从解纤维素枝顶孢分离出包含分类于内切葡聚糖酶、 β-葡萄糖苷酶的纤维素酶基因的基因组DNA，并解析其碱基序列，确定内切葡聚糖酶以及 β-葡萄糖苷酶基因。解决问题的方法
本专利技术为解决上述问题，对已知的内切葡聚糖酶以及葡萄糖苷酶的氨基酸序列进行了深入比较，发现了即使在解纤维素枝顶孢中也保守的氨基酸序列，并基于本信息设计了各种引物。使用这样设计的各种引物，以基因组DNA或cDNA作为模板实施了 PCR。 其结果得到了内切葡聚糖酶以及β -葡萄糖苷酶的基因片段，因而基于本基因片段设计引物，继续进行PCR，从而扩增出了 9种内切葡聚糖酶以及β-葡萄糖苷酶的基因，并进行了碱基序列解析，从而完成了本专利技术。S卩，本专利技术涉及选自以下的⑴、(ii)以及(iii)中的蛋白质⑴包含SEQ ID NO 2所述的氨基酸序列的1 306位的序列的蛋白质；(ii)包含在SEQ ID NO 2所述的氨基酸序列的I 306位的序列中，缺失、取代、和 /或添加I个或多个氨基酸而得到的氨基酸序列的内切葡聚糖酶；(iii)包含与SEQ ID NO 2所述的氨基酸序列的1 306位的序列具有70%以上的同一性的氨基酸序列的内切葡聚糖酶、选自以下的⑴、(ii)以及(iii)中的蛋白质⑴包含SEQ ID NO 4所述的氨基酸序列的1 475位的序列的蛋白质；(ii)包含在SEQ ID NO 4所述的氨基酸序列的I 475位的序列中，缺失、取代、和 /或添加I个或多个氨基酸而得到的氨基酸序列的内切葡聚糖酶；(iii)包含与SEQ ID NO 4所述的氨基酸序列的1 475位的序列具有70%以上的同一性的氨基酸序列的内切葡聚糖酶、选自以下的⑴、(ii)以及(iii)中的蛋白质⑴包含SEQ ID NO 6所述的氨基酸序列的1 391位的序列的蛋白质；(ii)包含在SEQ ID NO 6所述的氨基酸序列的I 391位的序列中，缺失、取代、和 /或添加I个或多个氨基酸而得到的氨基酸序列的内切葡聚糖酶；(iii)包含与SEQ ID NO 6所述的氨基酸序列的1 391位的序列具有70%以上的同一性的氨基酸序列的内切葡聚糖酶、选自以下的⑴、(ii)以及(iii)中的蛋白质⑴包含SEQ ID NO 8所述的氨基酸序列的1 376位的序列的蛋白质；(ii)包含在SEQ ID NO 8所述的氨基酸序列的I 376位的序列中，缺失、取代、和 /或添加I个或多个氨基酸而得到的氨基酸序列的内切葡聚糖酶；(iii)包含与SEQ ID NO 8所述的氨基酸序列的I 376位的序列具有70%以上的同一性的氨基酸序列的内切葡聚糖酶、选自以下的⑴、(ii)以及(iii)中的蛋白质(i)包含SEQ ID NO 10所述的氨基酸序列的I 221位的序列的蛋白质；(ii)包含在SEQ ID NO :10所述的氨基酸序列的f 221位的序列中，缺失、取代、 和/或添加I个或多个氨基酸而得到的氨基酸序列的内切葡聚糖酶；(iii)包含与SEQ ID NO 10所述的氨基酸序列的f 221位的序列具有70%以上的同一性的氨基酸序列的内切葡聚糖酶、选自以下的⑴、(ii)以及(iii)中的蛋白质⑴包含SEQ ID NO 12所述的氨基酸序列的1 319位的序列的蛋白质；(ii)包含在SEQ ID NO :12所述的氨基酸序列的f 319位的序列中，缺失、取代、 和/或添加I个或多个氨基酸而得到的氨基酸序列的内切葡聚糖酶；(iii)包含与SEQ ID NO 12所述的氨基酸序列的f 319位的序列具有70%以上的同一性的氨基酸序列的内切葡聚糖酶、选自以下的⑴、(ii)以及(iii)中的蛋白质⑴包含SEQ ID NO 14所述的氨基酸序列的1 301位的序列的蛋白质；(ii)包含在SEQ ID NO 14所述的氨基酸序列的I 301位的序列中，缺失、取代、 和/或添加I个或多个氨基酸而得到的氨基酸序列的内切葡聚糖酶；(iii)包含与SEQ ID NO 14所述的氨基酸序列的I 301位的序列具有70%以上的同一性的氨基酸序列的内切葡聚糖酶、选自以下的⑴、(ii)以及(iii)中的蛋白质⑴包含SEQ ID NO 16所述的氨基酸序列的I 458位的序列的蛋白质；(ii)包含在SEQ ID NO :16所述的氨基酸序列的I 458位的序列中，缺失、取代、 和/或添加I个或多个本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】
【专利技术属性】
技术研发人员：横山史和，
申请(专利权)人：明治制果药业株式会社，
类型：
国别省市：
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。